Prominin2調(diào)控鐵死亡抗性

    鐵死亡是一種以鐵依賴性的脂質(zhì)活性氧積累為特征的細(xì)胞死亡調(diào)控過程，它會(huì)導(dǎo)致缺血和變性疾病中病理性細(xì)胞丟失，并有可能誘發(fā)癌細(xì)胞死亡。細(xì)胞抵抗鐵死亡的能力各不相同，但其抵抗機(jī)制尚不清楚。今天小編給大家介紹發(fā)表于“Developmental Cell”上的文章“Prominin2 Drives Ferroptosis esistance by Stimulating Iron Export”。

結(jié) 果：
1.Prominin2一種鐵應(yīng)激反應(yīng)蛋白
    根據(jù)研究報(bào)道，我們認(rèn)為，在分離條件下存活的細(xì)胞可以通過上調(diào)保護(hù)基因表達(dá)程序來阻止細(xì)胞死亡。為了鑒定這些基因，我們通過RNA測序比較了粘附的和ECM脫離的MCF10A永生化乳腺上皮細(xì)胞中的mRNA表達(dá)。研究表明，在蛋白和mRNA水平上，ECM脫離后，MCF10A細(xì)胞中Prominin2迅速上調(diào)（圖1A和1B）。分離和粘附的Hs578t乳腺癌細(xì)胞中也觀察到編碼Prominin2的PROM2的增加。在ECM脫離條件下，MCF10A和Hs578t細(xì)胞中Prominin2表達(dá)的沉默導(dǎo)致了生存能力的顯著降低（圖1B，1C）。在這些條件下，細(xì)胞活力可以通過與一種特定的鐵死亡抑制劑ferrostatin- 1聯(lián)合處理而得到拯救（圖1C）。這些數(shù)據(jù)表明，ECM脫離時(shí)未能上調(diào)PROM2可能導(dǎo)致鐵死亡。
    接下來我們研究了GPX4的藥理學(xué)抑制是否改變了粘附細(xì)胞中Prominin2的表達(dá)并影響了鐵死亡。結(jié)果表明用共價(jià)GPX4抑制劑RSL3處理MCF10A和Hs578t細(xì)胞2小時(shí)會(huì)導(dǎo)致兩個(gè)細(xì)胞系中Prominin2 mRNA和蛋白表達(dá)增加（圖1D，1E）。與MCF10A和Hs578t細(xì)胞不同，RSL3在另一個(gè)乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞中沒有誘導(dǎo)Prominin2。我們觀察到Prominin2的表達(dá)與GPX4抑制引起的鐵死亡抗性相關(guān)。MCF10A和Hs578t細(xì)胞在2.5 mM濃度下對RSL3誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡有抗性，而MDA-MB-231細(xì)胞在0.5 mM濃度下被RSL3誘導(dǎo)死亡（圖1F）。

2.Prominin2增加對鐵死亡的抗性
    我們評估了prominin2是否對鐵死亡抗性是必要的。為此，我們沉默了MCF10A和Hs578t細(xì)胞中prominin2的表達(dá)，并與對照細(xì)胞比較，檢測了這些細(xì)胞對鐵死亡的敏感性。我們檢測了RSL3、ML210、FIN56和erastin。我們發(fā)現(xiàn)對照組MCF10A細(xì)胞比Hs578t細(xì)胞更耐這些化合物（圖2A，2B）。然而，在兩種細(xì)胞系中，在prominin2敲除細(xì)胞中觀察到對所有四種化合物的敏感性明顯增加。在prominin2缺失的細(xì)胞中，細(xì)胞活力的喪失被ferrostatin-1完全挽救了（圖2C）。根據(jù)基因沉默得到的結(jié)果，我們接下來測試了過表達(dá)的prominin2是否足以抑制鐵死亡。結(jié)果表明，在MDA-MB-231細(xì)胞中，外源性的prominin2表達(dá)足以抑制細(xì)胞死亡（圖2D）。因此，prominin2的表達(dá)促進(jìn)了對鐵死亡的抵抗。

3.Prominin2促進(jìn)MVBs的形成
    為了深入了解prominin2如何促進(jìn)鐵死亡抗性，我們評估了GPX4抑制后其亞細(xì)胞定位。免疫熒光顯微鏡顯示， GPX4抑制后，prominin2定位于離散的胞質(zhì)點(diǎn)狀突起（圖3A）。相比之下，在prominin2和TSG101之間觀察到一個(gè)顯著的共定位，TSG101是多泡體（MVBs）的標(biāo)記。GPX4抑制后30分鐘，prominin2和TSG101的共定位就很明顯，這種共定位在核周區(qū)域最為明顯（圖3B）。這一結(jié)果促使我們評估在GPX4抑制下，prominin2是否促進(jìn)MVB的形成。與對照細(xì)胞相比，RSL3處理的MCF10A和Hs578t細(xì)胞含有更多的TSG101陽性結(jié)構(gòu)，這表明GPX4抑制可以誘導(dǎo)MVB的形成（圖3A，3B）。然后，我們利用透射電子顯微鏡評估這些結(jié)構(gòu)的形成是否依賴于prominin2。事實(shí)上，RSL3處理的MCF10A細(xì)胞比對照細(xì)胞含有更多的MVBs，這種效應(yīng)在prominin2沉默細(xì)胞中沒有觀察到（圖3C）。免疫熒光顯微鏡還顯示，與對照組細(xì)胞相比，在prominin2缺失的MCF10A和Hs578t細(xì)胞中，TSG101陽性斑點(diǎn)減少（圖3D，3E）。相反，在MDA-MB-231細(xì)胞中，prominin2的表達(dá)增加了TSG101陽性結(jié)構(gòu)的數(shù)量，降低了對鐵死亡的敏感性（圖3F）。

4.多泡體的形成是避免鐵死亡的必要條件
    與MVBs在鐵死亡抗性上的因果作用相一致，TSG101表達(dá)的減少增加了MCF10A和Hs578t細(xì)胞對RSL3誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的敏感性（圖4A，4B），而這種死亡被ferrostatin-1挽救（圖4C）。這些數(shù)據(jù)表明，GPX4的抑制刺激了prominin2的表達(dá)和prominin2依賴的MVB的形成，從而促進(jìn)了鐵死亡抗性。
    為了評估GPX4抑制外泌體形成的影響，從對照細(xì)胞（DMSO）和經(jīng)RSL3處理的MCF10A和Hs578t細(xì)胞中提取外泌體。研究表明抑制GPX4增加了外泌體的形成（圖4D）。通過免疫印跡分析這些外泌體，發(fā)現(xiàn)它們含有prominin2、CD63和TSG101，這為它們是由prominin2依賴的MVB形成提供了證據(jù)（圖4D）。接著為了檢測外泌體的釋放是否對GPX4的抗性起關(guān)鍵作用，我們使用了鞘磷脂酶抑制劑GW4869。研究發(fā)現(xiàn)抑制外泌體的釋放增加了對照組MCF10A和Hs578t細(xì)胞對RSL3的敏感性，但未顯著影響prominin2缺失細(xì)胞的生存能力（圖4E）。

5.Prominin2和鐵蛋白參與游離鐵的調(diào)控
    我們推斷MVB/外泌體介導(dǎo)的鐵排出可抑制上鐵死亡。為了支持這一假設(shè)，我們觀察到鐵蛋白與prominin2在RSL3處理的MCF10A和Hs578t細(xì)胞中共定位（圖5A）。我們還鑒定了從這些細(xì)胞中提取的外泌體中的鐵蛋白（圖5B）。電感耦合等離子體質(zhì)譜法檢測到這些外泌體含有鐵。這進(jìn)一步支持了我們的假設(shè)。MDA-MB-231細(xì)胞在GPX4抑制后不增加鐵蛋白的表達(dá)。然而，與對照細(xì)胞相比，prominin2的表達(dá)誘導(dǎo)了RSL3處理細(xì)胞中更多的鐵蛋白定位（圖5C）。此外，鐵蛋白重鏈（FTH1）和輕鏈（FTL）的敲除增加了GPX4抑制MCF10A和Hs578t細(xì)胞的死亡（圖5D，5E）。重要的是，這一死亡是由ferrostatin-1或鐵螯合劑雙氧胺挽救的（圖5F）。

6.GPX4的抑制改變了游離鐵的濃度
    我們的數(shù)據(jù)表明，GPX4抑制刺激了含有鐵蛋白的MVBs的形成，這些結(jié)構(gòu)將鐵運(yùn)輸出細(xì)胞。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們量化了對照組和RSL3處理的MCF10A和Hs578t細(xì)胞的游離鐵濃度，發(fā)現(xiàn)兩組之間沒有顯著差異（圖6A）。然而，當(dāng)FTH1和FTL沉默后，我們觀察到RSL3處理后游離鐵的濃度增加（圖6A，6B）。通過對對照中游離鐵和GPX4抑制下表達(dá)prominin2的MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行定量分析，獲得了prominin2調(diào)控的鐵水平的額外證據(jù)。在這些細(xì)胞中，prominin2的表達(dá)阻止了RSL3引起的鐵元素的增加（圖6C）。此外，通過降低TSG101的表達(dá)來抑制MVB通路，可以顯著增加GPX4抑制后細(xì)胞內(nèi)游離鐵的濃度（圖6D）。這些結(jié)果表明，阻斷MVB/外泌體介導(dǎo)的鐵蛋白排出可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵蛋白在GPX4抑制下的積累。

7.ECM脫離的細(xì)胞通過Prominin2介導(dǎo)的MVB/外泌體的形成來抵抗鐵死亡
    基于ECM脫離是一種誘導(dǎo)prominin2表達(dá)的鐵脅迫，我們研究了prominin2是否促進(jìn)了ECM-脫離細(xì)胞中MVB的形成和鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)。研究表明，ECM脫離的、prominin2缺失的MCF10A和Hs578t細(xì)胞中的細(xì)胞死亡被鐵螯合劑去氧胺挽救（圖7A）。此外，與對照組細(xì)胞相比，ECM脫離增加了prominin2缺失細(xì)胞中游離鐵的濃度，這種效果在2小時(shí)后最明顯（圖7B）。與經(jīng)RSL3處理的貼壁細(xì)胞相似，經(jīng)TEM分析，ECM脫離增加了MVBs的頻率，這種增加依賴于prominin2 （圖7C）。此外，在ECM脫離的MCF10A和Hs578t細(xì)胞中，prominin2和TSG101的共定位也很明顯（圖7D）。這些結(jié)果表明，生理上的鐵應(yīng)激可以通過prominin2 /MVB的鐵輸出途徑來規(guī)避。

結(jié) 論：
    本研究利用RNA-seq鑒定了有助于抗鐵死亡的基因，發(fā)現(xiàn)促鐵死亡的刺激物誘導(dǎo)了prominin2的表達(dá)，并且prominin2與脂質(zhì)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)有關(guān)。Prominin2促進(jìn)了乳腺上皮和乳腺癌細(xì)胞的抗鐵死亡。機(jī)制上，prominin2促進(jìn)含鐵蛋白的多泡體）和外泌體的形成，這些外泌體將鐵轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，從而抑制了鐵死亡。這些發(fā)現(xiàn)表明，抗鐵死亡可以由prominin2-MVB-外泌體-鐵蛋白途徑驅(qū)動(dòng)，并且對鐵穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和癌癥具有廣泛的意義。