神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性外泌體miR-274靶向觸發(fā)氣管和突觸上按鈕以調(diào)節(jié)生長和對缺氧的反應(yīng)
神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性外泌體miRNA通過下調(diào)基因表達(dá)來調(diào)節(jié)器官/組織之間的通訊，從而調(diào)節(jié)發(fā)育和生理功能。但是，尚未正式確定特定miRNA的來源，途徑和功能。在這里，將顯示神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性外泌體miR-274非細(xì)胞自主調(diào)節(jié)突觸鈕扣和氣管分支的生長。
技術(shù)路線：
飼養(yǎng)第三期幼蟲用于實(shí)驗(yàn)cMyc及其調(diào)節(jié)劑在耐藥中的作用
免疫染色，顯微鏡和圖像處理解剖的三期幼蟲
解剖游走的幼蟲以進(jìn)行EDC固定的熒光原位雜交（FISH）并檢測前體miR-274
果蠅S2細(xì)胞培養(yǎng)物中分離外泌體并進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡
從幼蟲或外泌體組分中提取總RNA進(jìn)行RT-PCR和實(shí)時PCR
游蕩雌性幼蟲RNA測序以及螢光素酶的構(gòu)建和測定
對早期至三分齡幼蟲的行為分析
使用Graphpad Prism v6進(jìn)行統(tǒng)計分析
研究結(jié)果：
1.神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞需要miR-274來調(diào)節(jié)突觸和氣管生長
通過透射電子顯微鏡進(jìn)行的超微結(jié)構(gòu)分析表明神經(jīng)膠質(zhì)-突觸-氣管組織可能代表功能單元，其形成可能受到發(fā)育調(diào)控。篩選了一組miRNA基因敲除突變體，定量分析證實(shí)了miR-274活性的缺乏是兩個系統(tǒng)中生長缺陷的原因。同樣也證明缺乏miR-274的幼蟲無法發(fā)育出完整的突觸按鈕和氣管分支。采用了由細(xì)胞類型特異性GAL4驅(qū)動程序驅(qū)動的UAS-decoy-mir-274轉(zhuǎn)基因來抑制miR-274功能，證明了對miR-274的神經(jīng)膠質(zhì)抑制足以損害突觸和氣管生長。此外進(jìn)行了神經(jīng)膠質(zhì)搶救實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明了神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的miR-274促進(jìn)突觸鈕扣和氣管分支的生長。
2.miR-274前體和成熟形式的表達(dá)
FISH分別檢測了解剖的幼蟲切片中的miR-274的前體或成熟形式。干擾探針在幼蟲大腦中檢測到低背景或非特異性信號。用于檢測miR-274前體的環(huán)形探針在大腦中顯示出明顯的信號。這些信號位于由repo-GAL4驅(qū)動的mCD8-GFP標(biāo)記的膠質(zhì)細(xì)胞中，偶爾檢測到強(qiáng)核信號。相反，在突觸鈕扣和氣管分支中檢測到低背景信號。使用干探針來檢測成熟的miR-274。觀察到了強(qiáng)大而普遍存在的信號。這些信號也在肌肉細(xì)胞和突觸鈕扣內(nèi)以及氣管體和分支中檢測到。在mir-274KO突變體對照中未檢測到成熟miR-274的信號?？偨Y(jié)：miR-274前體主要在神經(jīng)膠質(zhì)中合成，并且成熟形式在肌肉，突觸鈕扣和氣管細(xì)胞中檢測到。
3.膠質(zhì)細(xì)胞中miR-274的外泌體分泌
在S2細(xì)胞提取物中檢測到miR-274。miR-274可能從S2細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中。S2細(xì)胞培養(yǎng)基分離的外泌體富含miR-274。在外泌體組分中檢測到了外泌體標(biāo)志物TSG101，Rab11和Syntaxin。在野生型幼蟲的血淋巴中檢測到大量的miR-274，而從mir-274KO突變體分離的血淋巴中則沒有。在來源于野生型對照和突變幼蟲的血淋巴的外泌體組分中檢測到典型的外泌體標(biāo)記物TSG101，Rab11和Syntaxin。因此，miR-274可以作為循環(huán)外泌體分泌到幼蟲的血淋巴和S2細(xì)胞培養(yǎng)基中。檢測神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可以在血液淋巴中分泌miR-274作為外泌體。我們對mir-274KO突變體中神經(jīng)元和氣管miR-274的表達(dá)進(jìn)行了相同的實(shí)驗(yàn)。僅在整個幼蟲裂解物中檢測到miR-274，但在分離的血淋巴或外泌體組分中未檢測到。通過絕對qPCR對血淋巴瘤中的miR-274水平進(jìn)行定量。
4.從膠質(zhì)細(xì)胞中分泌miR-274外泌體需要ESCRT組件，Rab11和Syx1A
通過repo-GAL4在膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)了Rab11RNAi或Syx1ARNAi。從淋巴中分離出來的外泌體中miR-274轉(zhuǎn)錄水平顯著降低。使用成熟的miR-274探針進(jìn)行了FISH，，miR-274信號描繪了鈕扣狀的形態(tài)，并在肌肉和氣管細(xì)胞中呈強(qiáng)烈的點(diǎn)狀。在Rab11或Syx1A的膠質(zhì)細(xì)胞敲低后未檢測到這些miR-274信號。Rab11或Syx1A的膠質(zhì)基因敲低導(dǎo)致突觸鈕扣和氣管分支的生長減少。敲除ESCRT-I復(fù)合物的TSG101和ESCRT-III復(fù)合物的Shrb，膠質(zhì)中TSG101或Shrb的RNAi敲除可有效抑制突觸和氣管生長。通過repo-GAL4在膠質(zhì)細(xì)胞中特異性表達(dá)TSG101RNAi或shrbRNAi時，從淋巴液分離出的外泌體中miR-274的水平降低。這些結(jié)果強(qiáng)烈表明，miR-274是作為外泌體的貨物分泌的，被釋放到血淋巴中以調(diào)節(jié)突觸和氣管的生長。
5.Sprouty作為miR-274調(diào)控的靶基因
搜索具有miR-274靶位點(diǎn)并在mir-274KO幼蟲中表達(dá)上調(diào)的基因。在最終的候選基因中，sty mRNA的3’UTR包含一個可識別miR-274的靶位點(diǎn)，具有靶向3'UTR的精確或錯配的miR-274序列。當(dāng)與miR-274共轉(zhuǎn)染時， miR-274靶向序列下調(diào)了報道分子活性。sty mRNA的表達(dá)可能受miR-274通過其3'UTR靶向序列的調(diào)控。在mir-274KO幼蟲中檢測到了更高的sty轉(zhuǎn)錄水平。通過進(jìn)行免疫染色，Sty受miR-274調(diào)節(jié)。檢測突觸終扣和野生型對照的氣管分支的Sty的表達(dá)，Sty水平都得到了增強(qiáng)。這由Sty免疫熒光強(qiáng)度的定量支持。在肌肉細(xì)胞中，Sty表達(dá)也被上調(diào)，表明miR-274可能在多個組織中發(fā)揮系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用。與野生型對照相比，mir-274KO的突觸鈕扣和氣管細(xì)胞中dpERK的水平大大降低，dpERK水平的下調(diào)也取決于Sty。在肌肉中也檢測到dpERK水平的恢復(fù)。減少miR-274突變體中的sty基因劑量可抑制兩種生長表型。這些結(jié)果表明miR-274抑制Sty表達(dá)，從而導(dǎo)致MAPK活化以促進(jìn)突觸鈕扣和氣管分支的生長。
6.膠質(zhì)細(xì)胞源性miR-274靶向突觸鈕和氣管內(nèi)的Sty，以調(diào)節(jié)其生長
首先在repo> decoy-mir-274幼蟲中進(jìn)行了免疫染色，該幼蟲的突觸和氣管生長降低了。將miR-274捕獲在膠質(zhì)細(xì)胞中會導(dǎo)致突觸后的bout和氣管分支的Sty水平更高。檢測到這兩個位點(diǎn)的dpERK水平降低。發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞拯救后，Sty降低，dpERK水平升高，并伴有突觸鈕扣數(shù)量增加和氣管分支。這些結(jié)果說明膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的miR-274到達(dá)目標(biāo)位點(diǎn)，以下調(diào)Sty表達(dá)并促進(jìn)突觸鈕扣和氣管分支的生長。最后，我們發(fā)現(xiàn)，該外來體生物發(fā)生，運(yùn)輸和釋放由Rab11，Syx1A，TSG101和SHRB的膠質(zhì)擊倒的中斷也引起麥粒腫上調(diào)和下調(diào)dpERK突觸終扣和氣管細(xì)胞。
7.miR-274調(diào)節(jié)幼蟲缺氧反應(yīng)
通過測定mir-274KO突變體的缺氧逃逸反應(yīng)，當(dāng)暴露于低氧環(huán)境中時，只有大約20％的對照幼蟲在5分鐘內(nèi)通過逃離食物來源做出了強(qiáng)烈反應(yīng)，到10分鐘時，這一比例增加到幾乎40％，接近15分鐘后達(dá)到50％。相比之下，近50％的mir-274KO突變體在5分鐘后表現(xiàn)出強(qiáng)烈的缺氧反應(yīng)，在10和15分鐘時表現(xiàn)出約60％的低氧反應(yīng)。當(dāng)我們在常氧環(huán)境下分析時，沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異，幾乎所有幼蟲（> 95％）都留在食物中。此外，證實(shí)了低氧誘導(dǎo)的反應(yīng)不是由于幼蟲運(yùn)動能力的差異所致，因?yàn)槲覀冇^察到了mir-274KO突變體和對照之間的爬蟲長度相當(dāng)。mir-274KO幼蟲確實(shí)對較低的氧氣含量具有更高的響應(yīng)能力。進(jìn)行了搶救實(shí)驗(yàn)，以檢查正常幼蟲缺氧反應(yīng)是否需要膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的miR-274。與攜帶repo-GAL4或UAS-mir-274轉(zhuǎn)基因的純合子mir-274KO突變體相比，攜帶repo-GAL4和UAS-mir-274轉(zhuǎn)基因的純合子mir-274KO突變體顯示出明顯降低的缺氧反應(yīng)。
通過突變進(jìn)行了Sty的遺傳抑制，發(fā)現(xiàn)在純合的mir-274KO突變體中引入sty突變體等位基因幾乎完全抑制了缺氧逃逸反應(yīng)的增強(qiáng)。在不存在miR-274的情況下，sty突變等位基因也可恢復(fù)氣管分支，因此該結(jié)果支持氣管分支與缺氧逃逸反應(yīng)相關(guān)。
總 結(jié)：
在這項研究中，作者探索了果蠅幼蟲神經(jīng)肌肉接頭（NMJ），其中軸突末端分支形成帶有肌肉膜的突觸鈕扣。我們證明NMJ還非常重視氣管末端分支，使其成為研究神經(jīng)和血管協(xié)調(diào)發(fā)育的理想系統(tǒng)。作者篩選了一組miRNA敲除突變體，并確定mir-274突變體在突觸和氣管生長中均具有缺陷。通過熒光原位雜交（FISH），表明miR-274前體在膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，成熟形式被普遍檢測。一致地，在膠質(zhì)細(xì)胞中需要miR-274來進(jìn)行突觸和氣管生長?？梢栽谟紫x循環(huán)系統(tǒng)的血淋巴中檢測到miR-274的神經(jīng)膠質(zhì)表達(dá)。確實(shí)，如遺傳分析和生化分級分析所示，miR-274被分泌為外泌體貨物。我們鑒定出一個miR-274靶標(biāo)發(fā)芽（sty），該靶標(biāo)在sty轉(zhuǎn)錄本的3'UTR中包含一個靶標(biāo)位點(diǎn)，并表明神經(jīng)膠質(zhì)miR-274的表達(dá)可誘導(dǎo)突觸管和氣管分支中的Sty下調(diào)和MAPK活化。有趣的是，氣管分支較少的mir-274突變體對缺氧過敏，并且兩種表型均被抑制。