神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性外泌體miR-274靶向觸發(fā)氣管和突觸上按鈕以調(diào)節(jié)生長(zhǎng)和對(duì)缺氧的反應(yīng)
神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性外泌體miRNA通過(guò)下調(diào)基因表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)器官/組織之間的通訊，從而調(diào)節(jié)發(fā)育和生理功能。但是，尚未正式確定特定miRNA的來(lái)源，途徑和功能。在這里，將顯示神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性外泌體miR-274非細(xì)胞自主調(diào)節(jié)突觸鈕扣和氣管分支的生長(zhǎng)。
技術(shù)路線：
飼養(yǎng)第三期幼蟲(chóng)用于實(shí)驗(yàn)cMyc及其調(diào)節(jié)劑在耐藥中的作用
免疫染色，顯微鏡和圖像處理解剖的三期幼蟲(chóng)
解剖游走的幼蟲(chóng)以進(jìn)行EDC固定的熒光原位雜交（FISH）并檢測(cè)前體miR-274
果蠅S2細(xì)胞培養(yǎng)物中分離外泌體并進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡
從幼蟲(chóng)或外泌體組分中提取總RNA進(jìn)行RT-PCR和實(shí)時(shí)PCR
游蕩雌性幼蟲(chóng)RNA測(cè)序以及螢光素酶的構(gòu)建和測(cè)定
對(duì)早期至三分齡幼蟲(chóng)的行為分析
使用Graphpad Prism v6進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析
研究結(jié)果：
1.神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞需要miR-274來(lái)調(diào)節(jié)突觸和氣管生長(zhǎng)
通過(guò)透射電子顯微鏡進(jìn)行的超微結(jié)構(gòu)分析表明神經(jīng)膠質(zhì)-突觸-氣管組織可能代表功能單元，其形成可能受到發(fā)育調(diào)控。篩選了一組miRNA基因敲除突變體，定量分析證實(shí)了miR-274活性的缺乏是兩個(gè)系統(tǒng)中生長(zhǎng)缺陷的原因。同樣也證明缺乏miR-274的幼蟲(chóng)無(wú)法發(fā)育出完整的突觸按鈕和氣管分支。采用了由細(xì)胞類型特異性GAL4驅(qū)動(dòng)程序驅(qū)動(dòng)的UAS-decoy-mir-274轉(zhuǎn)基因來(lái)抑制miR-274功能，證明了對(duì)miR-274的神經(jīng)膠質(zhì)抑制足以損害突觸和氣管生長(zhǎng)。此外進(jìn)行了神經(jīng)膠質(zhì)搶救實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明了神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的miR-274促進(jìn)突觸鈕扣和氣管分支的生長(zhǎng)。
2.miR-274前體和成熟形式的表達(dá)
FISH分別檢測(cè)了解剖的幼蟲(chóng)切片中的miR-274的前體或成熟形式。干擾探針在幼蟲(chóng)大腦中檢測(cè)到低背景或非特異性信號(hào)。用于檢測(cè)miR-274前體的環(huán)形探針在大腦中顯示出明顯的信號(hào)。這些信號(hào)位于由repo-GAL4驅(qū)動(dòng)的mCD8-GFP標(biāo)記的膠質(zhì)細(xì)胞中，偶爾檢測(cè)到強(qiáng)核信號(hào)。相反，在突觸鈕扣和氣管分支中檢測(cè)到低背景信號(hào)。使用干探針來(lái)檢測(cè)成熟的miR-274。觀察到了強(qiáng)大而普遍存在的信號(hào)。這些信號(hào)也在肌肉細(xì)胞和突觸鈕扣內(nèi)以及氣管體和分支中檢測(cè)到。在mir-274KO突變體對(duì)照中未檢測(cè)到成熟miR-274的信號(hào)?？偨Y(jié)：miR-274前體主要在神經(jīng)膠質(zhì)中合成，并且成熟形式在肌肉，突觸鈕扣和氣管細(xì)胞中檢測(cè)到。
3.膠質(zhì)細(xì)胞中miR-274的外泌體分泌
在S2細(xì)胞提取物中檢測(cè)到miR-274。miR-274可能從S2細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中。S2細(xì)胞培養(yǎng)基分離的外泌體富含miR-274。在外泌體組分中檢測(cè)到了外泌體標(biāo)志物TSG101，Rab11和Syntaxin。在野生型幼蟲(chóng)的血淋巴中檢測(cè)到大量的miR-274，而從mir-274KO突變體分離的血淋巴中則沒(méi)有。在來(lái)源于野生型對(duì)照和突變幼蟲(chóng)的血淋巴的外泌體組分中檢測(cè)到典型的外泌體標(biāo)記物TSG101，Rab11和Syntaxin。因此，miR-274可以作為循環(huán)外泌體分泌到幼蟲(chóng)的血淋巴和S2細(xì)胞培養(yǎng)基中。檢測(cè)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可以在血液淋巴中分泌miR-274作為外泌體。我們對(duì)mir-274KO突變體中神經(jīng)元和氣管miR-274的表達(dá)進(jìn)行了相同的實(shí)驗(yàn)。僅在整個(gè)幼蟲(chóng)裂解物中檢測(cè)到miR-274，但在分離的血淋巴或外泌體組分中未檢測(cè)到。通過(guò)絕對(duì)qPCR對(duì)血淋巴瘤中的miR-274水平進(jìn)行定量。
4.從膠質(zhì)細(xì)胞中分泌miR-274外泌體需要ESCRT組件，Rab11和Syx1A
通過(guò)repo-GAL4在膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)了Rab11RNAi或Syx1ARNAi。從淋巴中分離出來(lái)的外泌體中miR-274轉(zhuǎn)錄水平顯著降低。使用成熟的miR-274探針進(jìn)行了FISH，，miR-274信號(hào)描繪了鈕扣狀的形態(tài)，并在肌肉和氣管細(xì)胞中呈強(qiáng)烈的點(diǎn)狀。在Rab11或Syx1A的膠質(zhì)細(xì)胞敲低后未檢測(cè)到這些miR-274信號(hào)。Rab11或Syx1A的膠質(zhì)基因敲低導(dǎo)致突觸鈕扣和氣管分支的生長(zhǎng)減少。敲除ESCRT-I復(fù)合物的TSG101和ESCRT-III復(fù)合物的Shrb，膠質(zhì)中TSG101或Shrb的RNAi敲除可有效抑制突觸和氣管生長(zhǎng)。通過(guò)repo-GAL4在膠質(zhì)細(xì)胞中特異性表達(dá)TSG101RNAi或shrbRNAi時(shí)，從淋巴液分離出的外泌體中miR-274的水平降低。這些結(jié)果強(qiáng)烈表明，miR-274是作為外泌體的貨物分泌的，被釋放到血淋巴中以調(diào)節(jié)突觸和氣管的生長(zhǎng)。
5.Sprouty作為miR-274調(diào)控的靶基因
搜索具有miR-274靶位點(diǎn)并在mir-274KO幼蟲(chóng)中表達(dá)上調(diào)的基因。在最終的候選基因中，sty mRNA的3’UTR包含一個(gè)可識(shí)別miR-274的靶位點(diǎn)，具有靶向3'UTR的精確或錯(cuò)配的miR-274序列。當(dāng)與miR-274共轉(zhuǎn)染時(shí)， miR-274靶向序列下調(diào)了報(bào)道分子活性。sty mRNA的表達(dá)可能受miR-274通過(guò)其3'UTR靶向序列的調(diào)控。在mir-274KO幼蟲(chóng)中檢測(cè)到了更高的sty轉(zhuǎn)錄水平。通過(guò)進(jìn)行免疫染色，Sty受miR-274調(diào)節(jié)。檢測(cè)突觸終扣和野生型對(duì)照的氣管分支的Sty的表達(dá)，Sty水平都得到了增強(qiáng)。這由Sty免疫熒光強(qiáng)度的定量支持。在肌肉細(xì)胞中，Sty表達(dá)也被上調(diào)，表明miR-274可能在多個(gè)組織中發(fā)揮系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用。與野生型對(duì)照相比，mir-274KO的突觸鈕扣和氣管細(xì)胞中dpERK的水平大大降低，dpERK水平的下調(diào)也取決于Sty。在肌肉中也檢測(cè)到dpERK水平的恢復(fù)。減少miR-274突變體中的sty基因劑量可抑制兩種生長(zhǎng)表型。這些結(jié)果表明miR-274抑制Sty表達(dá)，從而導(dǎo)致MAPK活化以促進(jìn)突觸鈕扣和氣管分支的生長(zhǎng)。
6.膠質(zhì)細(xì)胞源性miR-274靶向突觸鈕和氣管內(nèi)的Sty，以調(diào)節(jié)其生長(zhǎng)
首先在repo> decoy-mir-274幼蟲(chóng)中進(jìn)行了免疫染色，該幼蟲(chóng)的突觸和氣管生長(zhǎng)降低了。將miR-274捕獲在膠質(zhì)細(xì)胞中會(huì)導(dǎo)致突觸后的bout和氣管分支的Sty水平更高。檢測(cè)到這兩個(gè)位點(diǎn)的dpERK水平降低。發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞拯救后，Sty降低，dpERK水平升高，并伴有突觸鈕扣數(shù)量增加和氣管分支。這些結(jié)果說(shuō)明膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的miR-274到達(dá)目標(biāo)位點(diǎn)，以下調(diào)Sty表達(dá)并促進(jìn)突觸鈕扣和氣管分支的生長(zhǎng)。最后，我們發(fā)現(xiàn)，該外來(lái)體生物發(fā)生，運(yùn)輸和釋放由Rab11，Syx1A，TSG101和SHRB的膠質(zhì)擊倒的中斷也引起麥粒腫上調(diào)和下調(diào)dpERK突觸終扣和氣管細(xì)胞。
7.miR-274調(diào)節(jié)幼蟲(chóng)缺氧反應(yīng)
通過(guò)測(cè)定mir-274KO突變體的缺氧逃逸反應(yīng)，當(dāng)暴露于低氧環(huán)境中時(shí)，只有大約20％的對(duì)照幼蟲(chóng)在5分鐘內(nèi)通過(guò)逃離食物來(lái)源做出了強(qiáng)烈反應(yīng)，到10分鐘時(shí)，這一比例增加到幾乎40％，接近15分鐘后達(dá)到50％。相比之下，近50％的mir-274KO突變體在5分鐘后表現(xiàn)出強(qiáng)烈的缺氧反應(yīng)，在10和15分鐘時(shí)表現(xiàn)出約60％的低氧反應(yīng)。當(dāng)我們?cè)诔Ｑ醐h(huán)境下分析時(shí)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著差異，幾乎所有幼蟲(chóng)（> 95％）都留在食物中。此外，證實(shí)了低氧誘導(dǎo)的反應(yīng)不是由于幼蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力的差異所致，因?yàn)槲覀冇^察到了mir-274KO突變體和對(duì)照之間的爬蟲(chóng)長(zhǎng)度相當(dāng)。mir-274KO幼蟲(chóng)確實(shí)對(duì)較低的氧氣含量具有更高的響應(yīng)能力。進(jìn)行了搶救實(shí)驗(yàn)，以檢查正常幼蟲(chóng)缺氧反應(yīng)是否需要膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的miR-274。與攜帶repo-GAL4或UAS-mir-274轉(zhuǎn)基因的純合子mir-274KO突變體相比，攜帶repo-GAL4和UAS-mir-274轉(zhuǎn)基因的純合子mir-274KO突變體顯示出明顯降低的缺氧反應(yīng)。
通過(guò)突變進(jìn)行了Sty的遺傳抑制，發(fā)現(xiàn)在純合的mir-274KO突變體中引入sty突變體等位基因幾乎完全抑制了缺氧逃逸反應(yīng)的增強(qiáng)。在不存在miR-274的情況下，sty突變等位基因也可恢復(fù)氣管分支，因此該結(jié)果支持氣管分支與缺氧逃逸反應(yīng)相關(guān)。
總 結(jié)：
在這項(xiàng)研究中，作者探索了果蠅幼蟲(chóng)神經(jīng)肌肉接頭（NMJ），其中軸突末端分支形成帶有肌肉膜的突觸鈕扣。我們證明NMJ還非常重視氣管末端分支，使其成為研究神經(jīng)和血管協(xié)調(diào)發(fā)育的理想系統(tǒng)。作者篩選了一組miRNA敲除突變體，并確定mir-274突變體在突觸和氣管生長(zhǎng)中均具有缺陷。通過(guò)熒光原位雜交（FISH），表明miR-274前體在膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，成熟形式被普遍檢測(cè)。一致地，在膠質(zhì)細(xì)胞中需要miR-274來(lái)進(jìn)行突觸和氣管生長(zhǎng)?？梢栽谟紫x(chóng)循環(huán)系統(tǒng)的血淋巴中檢測(cè)到miR-274的神經(jīng)膠質(zhì)表達(dá)。確實(shí)，如遺傳分析和生化分級(jí)分析所示，miR-274被分泌為外泌體貨物。我們鑒定出一個(gè)miR-274靶標(biāo)發(fā)芽（sty），該靶標(biāo)在sty轉(zhuǎn)錄本的3'UTR中包含一個(gè)靶標(biāo)位點(diǎn)，并表明神經(jīng)膠質(zhì)miR-274的表達(dá)可誘導(dǎo)突觸管和氣管分支中的Sty下調(diào)和MAPK活化。有趣的是，氣管分支較少的mir-274突變體對(duì)缺氧過(guò)敏，并且兩種表型均被抑制。