circRNA促進(jìn)肝癌干細(xì)胞自我更新

    隨著高通量RNA測(cè)序的發(fā)展和新穎的計(jì)算方法，在真核生物中已發(fā)現(xiàn)大量?jī)?nèi)源的、保守的、穩(wěn)定的和特異性的環(huán)狀RNA（circRNA）。癌癥干細(xì)胞（CSC）具有自我更新潛力，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。然而，尚不清楚在癌癥中circRNA如何調(diào)控CSC 。今日，小編帶大家一探其奧秘。

技術(shù)路線：

結(jié) 果：
1. Circ-MALAT1在肝CSCs中高表達(dá)
    患者實(shí)體瘤中獲得肝細(xì)胞癌的原代細(xì)胞（HCC）和CSC，進(jìn)行circRNA-seq，發(fā)現(xiàn)共有193個(gè)circRNA在肝細(xì)胞CSC中異常表達(dá)，其中兩個(gè)被下調(diào)，十八個(gè)包括MALAT1在內(nèi)的circRNA鑒定為異位表達(dá)。使用聚合引物和發(fā)散引物確認(rèn)發(fā)現(xiàn)的circRNA確實(shí)是首尾相連環(huán)狀結(jié)構(gòu)，九種候選circRNA對(duì)RNase R具有抗性，進(jìn)一步驗(yàn)證circRNA的環(huán)狀封閉結(jié)構(gòu)。9個(gè)中MALAT1呈現(xiàn)出更高的CSCs中的表達(dá)水平。

2. Circ-MALAT1促進(jìn)肝細(xì)胞CSCs的自我更新
    與circ-MALAT1側(cè)翼結(jié)合的剪接相關(guān)因子中，AUF1 mRNA在CSC中表達(dá)上調(diào)，AUF1蛋白與MALAT1前端綁定，Huh7細(xì)胞沉默AUF1降低了circ-MALAT1的表達(dá)。circ-SPARC在CSC與匹配的臨近細(xì)胞之間無(wú)差異，作為陰性對(duì)照。HCC細(xì)胞過(guò)表達(dá)circ-MALAT1形成更多懸浮球，體內(nèi)注射的circ-MALAT1過(guò)表達(dá)細(xì)胞導(dǎo)致更大生長(zhǎng)更快的腫瘤。這些表明，circ-MALAT1在AUF1的協(xié)調(diào)下在HCC中促進(jìn)了CSC進(jìn)行自我更新。

3.Circ-MALAT1的表達(dá)導(dǎo)致JAK2和PAX5的差異表達(dá)
    蛋白陣列顯示MALAT1過(guò)表達(dá)后224個(gè)蛋白質(zhì)上調(diào)和43個(gè)蛋白質(zhì)下調(diào)，GO分析有96個(gè)上調(diào)蛋白參與CSCs自我更新或腫瘤轉(zhuǎn)移和增殖。在三個(gè)最顯著富集GO中，選擇五個(gè)倍數(shù)變化最大的蛋白（FGF2，TGFB1，PTK2，JAK2和GH1）作進(jìn)一步研究。在43種下調(diào)的蛋白中，有10種參與腫瘤抑制。HCC細(xì)胞過(guò)表達(dá)circ-MALAT1后Janus激活激酶2（JAK2）蛋白增加，PAX5下調(diào)明顯。敲低circ-MALAT1后結(jié)果相反。此外，Huh7細(xì)胞circ-MALAT1過(guò)表達(dá)產(chǎn)生的異種移植腫瘤表現(xiàn)出較高的JAK2和較低的PAX5蛋白表達(dá)。這些結(jié)果表明circ-MALAT1可能導(dǎo)致肝細(xì)胞CSC中JAK2上調(diào)和PAX5的下調(diào)。

4. Circ-MALAT1通過(guò)與PAX5編碼序列和核糖體結(jié)合而阻礙PAX5的翻譯
    熒光原位雜交發(fā)現(xiàn)circ-MALAT1是位于細(xì)胞質(zhì)，過(guò)表達(dá)circ-MALAT1后PAX5 mRNA的表達(dá)無(wú)變化，這表明circ-MALAT1可能在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用。MALAT1和PAX5可與核糖體結(jié)合，裂解轉(zhuǎn)染circ-MALAT1 IRES突變質(zhì)粒的Huh7細(xì)胞進(jìn)行RIP分析，來(lái)自circ-MALAT1 IRES2突變樣品的抗rps6 RIP產(chǎn)物的數(shù)量比IgG對(duì)照增加了2- 3倍，而IRES1突變則沒(méi)有差異，表明共識(shí)IRES1和IRES2的序列（位置640–755）為circ-MALAT1與核糖體結(jié)合所必需。生物素標(biāo)記的PAX5 mRNA特異性探針進(jìn)行體內(nèi)RNA下拉實(shí)驗(yàn)，Huh7中PAX5 mRNA的富集水平都相當(dāng)，circ-MALAT1的富集倍數(shù)在突變體遠(yuǎn)低于那些在WT中，表明11個(gè)堿基對(duì)于circ-MALAT1結(jié)合PAX5 mRNA至關(guān)重要。circ-MALAT1過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中PAX5蛋白及其下游蛋白p53的表達(dá)下調(diào)，PAX5和p53在CSC中被下調(diào)。轉(zhuǎn)染W(wǎng)T circ-MALAT1的細(xì)胞中，只有PAX5蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，而轉(zhuǎn)染了circ-MALAT1 ires2突變體的細(xì)胞中，PAX5蛋白表達(dá)輕微下調(diào)。

5. Circ-MALAT1作為miR-6887-3p海綿上調(diào)JAK2
    篩選預(yù)測(cè)出121個(gè)靶向JAK2的miRNA，circ-MALAT1過(guò)表達(dá)miR-6887-3p表達(dá)降低，下拉實(shí)驗(yàn)表明circ-MALAT1特異探針可有效拉低circ-MALAT1，miR-6887-3p也顯著富集。miR-6887-3p模仿物處理的Huh7細(xì)胞不影響JAK2 mRNA水平，但JAK2蛋白減少。表明miR-6887-3p可以在轉(zhuǎn)錄后水平抑制JAK2表達(dá)。pMIR-JAK2-3’UTR WT的螢光素酶活性可以被miR-6887-3p模擬有效抑制。circ-MALAT1的過(guò)表達(dá)減弱miR-6887-3p的JAK2抑制作用，從而增加了JAK2和其磷酸化水平，促進(jìn)STAT3的磷酸化和激活，JAK2 / STAT3信號(hào)通路中的三大關(guān)鍵蛋白分子JAK2，磷酸JAK2（p-JAK2）和磷酸STAT3（p-STAT3）在CSC中被上調(diào)。

6. Circ-MALAT1在體內(nèi)吸附miR-6887-3p上調(diào)JAK2
    為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-6887-3p在體內(nèi)的特異性，在異種移植腫瘤中用miRNA模擬物或抑制劑進(jìn)行治療，miR-6887-3p模擬物不影響JAK2 mRNA和circ-MALAT1的表達(dá)，JAK2蛋白顯著降低，用miR-6887-3p抑制劑治療又相反趨勢(shì)。另外，由于MALAT1減弱了miR-6887-3p對(duì)JAK2蛋白的抑制作用，p-JAK2表達(dá)增加。以上表明，CSC中的circ-MALAT1上調(diào)可以吸附miR-6887-3p，增強(qiáng)JAK2 / STAT3途徑活性促進(jìn)肝細(xì)胞CSC自我更新能力。

7. circ-MALAT1同時(shí)作為mRNA翻譯制動(dòng)器和miRNA海綿促進(jìn)肝細(xì)胞CSCs自我更新