CircRNA調(diào)控組蛋白修飾在胃癌中的研究

    胃癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，迫切需要更有效的生物標(biāo)志物和靶標(biāo)以進(jìn)行更好的診斷和治療胃癌。circRNA可作為癌癥的潛在診斷生物標(biāo)志物，并代表新的治療目標(biāo)。今日這篇文章和大家一起探索circRNA在胃癌中的功能和潛在機(jī)制。
技術(shù)路線：

結(jié) 果：
1.人胃癌組織中環(huán)狀RNA (circMRPS35)的鑒定與驗(yàn)證
    RNA測(cè)序分析癌組織和鄰近的正常組織中circRNA表達(dá)，13個(gè)circRNA在胃癌中明顯下調(diào)，有9個(gè)上調(diào)。在30對(duì)胃癌和鄰近正常組織中驗(yàn)證表達(dá)，發(fā)現(xiàn)源自MRPS35基因的circ_0000384差異最顯著。發(fā)散和聚合引物PCR擴(kuò)增以及Sanger測(cè)序證實(shí)circRNA的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，circMRPS35具有更高的RNA酶抵抗力，轉(zhuǎn)錄抑制劑Dactinomycin D處理后circMRPS35比MRPS35 mRNA穩(wěn)定。以上表明，circMRPS35是在胃癌組織中低表達(dá)的穩(wěn)定circRNA。

2.CircMRPS35表達(dá)與胃癌的良好預(yù)后相關(guān)
    circMRPS35在胃癌組織的表達(dá)顯著減少，circMRPS35的表達(dá)水平與晚期腫瘤結(jié)轉(zhuǎn)移（TNM）分期、淋巴轉(zhuǎn)移和腫瘤大小呈負(fù)相關(guān)，ROC曲線分析表明circMRPS35可用于預(yù)測(cè)患者的預(yù)后。

3.體外CircMRPS35抑制胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移
    為評(píng)估circMRPS35的功能，分析circMRPS35在各種人類胃癌細(xì)胞系和GES-1細(xì)胞的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)circMRPS35水平在SGC7901和MKN28細(xì)胞中較低。質(zhì)粒pCDH-CMVCircMRPS35轉(zhuǎn)染后，明顯增加，在SGC7901和MKN28細(xì)胞中過(guò)表達(dá)CircMRPS35，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G1期，抑制細(xì)胞侵襲。siRNA抑制circMRPS35表達(dá)，明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期加速和侵襲。這些結(jié)果驗(yàn)證circMRPS35可以調(diào)節(jié)體外培養(yǎng)胃癌細(xì)胞的行為。

4.體內(nèi)CircMRPS35抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移
    在體內(nèi)，circMRPS35降低異種移植小鼠模型中的腫瘤生長(zhǎng)和重量，circMRPS35過(guò)表達(dá)的腫瘤中Ki-67和PCNA降低，裸鼠肺中的轉(zhuǎn)移灶降低。shRNA慢病毒抑制CircMRPS35則增加了腫瘤的生長(zhǎng)、腫瘤的重量以及Ki-67和PCNA的表達(dá)，增加裸鼠肺部轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量。

5.CircMRPS35通過(guò)FOXO1和FOXO3a的轉(zhuǎn)錄激活抑制胃癌進(jìn)展
    circMRPS35敲低后進(jìn)行RNA序列，GO和KEGG分析表明FOXO信號(hào)是circMRPS35參與癌癥調(diào)節(jié)最相關(guān)的信號(hào)。FOXO家族是進(jìn)化保守的，包括FOXO1，F(xiàn)OXO3a，F(xiàn)OXO4和FOXO6四個(gè)成員。circMRPS35增加FOXO1和FOXO3a的mRNA和蛋白質(zhì)水平，CircMRPS35敲低對(duì)FOXO1和FOXO3a的磷酸化沒(méi)有影響。circMRPS35改變FOXO1和FOXO3a的靶基因（p21，p27，Twist1，E-cadherin）的表達(dá)，F(xiàn)OXO1的減少顯著減弱circMRPS35的促進(jìn)p21和p27表達(dá)，挽救細(xì)胞周期停滯并抑制細(xì)胞增殖。熒光原位雜交表明circMRPS35主要位于細(xì)胞核內(nèi)，circMRPS35增強(qiáng)FOXO1和FOXO3a的啟動(dòng)子活性?？偠灾?，circMRPS35通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活FOXO1和FOXO3a抑制胃癌細(xì)胞的行為。

6.CircMRPS35的表達(dá)與胃癌組織中的FOXO3a和FOXO1對(duì)應(yīng)
    胃癌組織中FOXO1或FOXO3a表達(dá)均顯著下降，F(xiàn)OXO1的表達(dá)與呈腫瘤大小負(fù)相關(guān)，F(xiàn)OXO3a表達(dá)與晚期TNM階段、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。ROC曲線表明FOXO1和FOXO3a表達(dá)可用于預(yù)測(cè)患者的預(yù)后。FOXO1或FOXO3a的低表達(dá)與胃癌患者的不良生存密切相關(guān)，F(xiàn)OXO1和FOXO3a表達(dá)與circMRPS35呈正相關(guān)。這些表明circMRPS35介導(dǎo)的FOXO1和FOXO3a信號(hào)在胃癌中起關(guān)鍵作用。

7.CircMRPS35招募KAT7到FOXO1和FOXO3a基因的啟動(dòng)子
    進(jìn)一步研究circMRPS35激活FOXO1和FOXO3a轉(zhuǎn)錄的機(jī)制，細(xì)胞裂解物與生物素化circMRPS35探針?lè)跤琑NA下拉測(cè)定和質(zhì)譜分析參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的蛋白質(zhì)KAT7。在MGC803細(xì)胞核中circMRPS35 與KAT7共定位，circMRPS35片段形成多個(gè)氫鍵與KAT7殘基相互作用，KAT7（256-315aa）C2H2域?qū)εccircMRPS35的相互作用至關(guān)重要。FOXO1和FOXO3a啟動(dòng)子區(qū)域中H4K5ac，H4K12ac和H3K14ac的表達(dá)富集，ChIP證明只有H4K5ac結(jié)合到FOXO3a和FOXO1的啟動(dòng)子區(qū)域，RNA下拉和RIP證明H4K5ac與circMRPS35特異性相互作用，circMRPS35與KAT7和H4K5ac表明circMRPS35與H4K5ac和KAT7相互作用形成三聚體。在circMRPS35 /KAT7/H4K5ac的復(fù)合物中，H4K5ac殘基77-84?？縆AT7形成的口袋中，H4K5ac具有α-螺旋基序的殘基54–77與KAT7的563-576位殘基相互作用，circMRPS35直接與FOXO1和FOXO3a啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合。以上表明circMRPS35將KAT7募集到FOXO1和FOXO3a的啟動(dòng)子。KAT7的敲低減弱circMRPS35增加的FOXO1和FOXO3a基因啟動(dòng)子處H4K5ac水平，敲低KAT7大大降低circMRPS35誘導(dǎo)的FOXO1和FOXO3amRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)。以上表明，circMRPS35通過(guò)招募KAT7增加了FOXO1和FOXO3a啟動(dòng)子區(qū)域中的H4K5的乙酰化水平。