新機(jī)制—CAF外泌體調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞鐵死亡

    鐵死亡是一種新的非凋亡性細(xì)胞死亡方式，由鐵依賴性的脂質(zhì)過(guò)氧化物的積累引起。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）通過(guò)分泌多種生物活性物質(zhì)支持腫瘤的進(jìn)展和耐藥性。然而，CAFs在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞脂質(zhì)代謝和鐵死亡中的作用仍然是未知的。接下來(lái)，小編為大家講解發(fā)表于“Molecular Cancer”上的文章“CAF secreted miR-522 suppressesferroptosis and promotes acquired chemo-resistance in gastric cancer”。

    在本研究中，我們應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)篩選胃癌中鐵死亡相關(guān)基因，超離心法分離外泌體，RT-qPCR法檢測(cè)CAF分泌的miRNAs。以Erastin誘導(dǎo)鐵死亡，通過(guò)測(cè)定脂質(zhì)ROS、細(xì)胞活力和線粒體膜電位來(lái)評(píng)價(jià)鐵死亡程度。
結(jié) 果：
1）GC中與鐵死亡相關(guān)的關(guān)鍵基因的篩選
    我們首先用質(zhì)譜法比較了GC特異性蛋白，發(fā)現(xiàn)GC腫瘤組織（T）中的一組蛋白表達(dá)明顯低于癌旁組織（P）。ALOX15是導(dǎo)致鐵死亡的關(guān)鍵基因之一，呈急劇下降趨勢(shì)，而腫瘤組織中USP7和hnRNPA1的水平明顯升高（圖1a）。隨后，測(cè)定ALOX15蛋白和mRNA。ALXO15蛋白總體呈下降趨勢(shì)，但ALOX15mRNA無(wú)明顯變化（圖1b-d）。我們還通過(guò)IHC檢測(cè)了ALOX15的分布，ALOX15主要在癌旁組織的腺體細(xì)胞中表達(dá)，少量在腺瘤細(xì)胞中表達(dá)（圖1e）。根據(jù)ALOX15蛋白水平的平均值，將GC患者分為ALOX15高組和ALOX15低組。高水平的ALOX15蛋白與胃癌患者的總生存率（OS）有更好的相關(guān)性（圖1f）。脂質(zhì)ROS是ALOX15產(chǎn)生的一種重要代謝物。在腫瘤組織中脂質(zhì)ROS的水平明顯降低（圖1g），并且與ALOX15呈正相關(guān)（圖1h）。這些數(shù)據(jù)表明，ALOX15在調(diào)節(jié)胃腫瘤脂質(zhì)活性氧生成中起著關(guān)鍵作用。

2）外泌體miR-522主要來(lái)源于腫瘤微環(huán)境中的CAFs
    雖然我們已經(jīng)證明miR-522在GC中明顯上調(diào)，但是miR-522的起源仍然不清楚。分離癌組織中CAFs和癌旁正常成纖維細(xì)胞（NFs），檢測(cè)原代細(xì)胞和外泌體miR-522水平。與NFs相比，CAFs中CAFs、α-SMA、FAP和FSP1的標(biāo)記物均明顯增加（圖2a和b）。與腫瘤細(xì)胞和NFs相比，CAFs中miR-522的濃度最高（圖2c）。NFs、TCs和CAFs的外泌體按上述方法分離并拍攝（圖2d），外泌體的標(biāo)記物通過(guò)WB分析檢測(cè)（圖2e）。miR-522在CAF外泌體中的含量最高，其次是TC外泌體（圖2f）。正如預(yù)期的那樣，來(lái)自CAFs的外泌體miR-522也與ALOX15和脂質(zhì)ROS呈負(fù)相關(guān)（圖2g和h）。這些數(shù)據(jù)表明，GC腫瘤微環(huán)境中的exo-miR-522主要由CAFs分泌。

3）CAFs分泌的exo-miR-522抑制GC細(xì)胞的鐵死亡
    為探討CAFs來(lái)源的exo-miR-522對(duì)胃癌細(xì)胞鐵死亡的調(diào)節(jié)作用，分離CAF外泌體并與人胃癌細(xì)胞株共培養(yǎng)。SGC7901細(xì)胞、MGC803細(xì)胞和MKN45細(xì)胞分泌的外泌體照片如圖3a所示，這些外泌體還含有CD63、TSG101和Alix（圖3b）。CAFs中miR-522的含量是GC細(xì)胞株的6倍，在外泌體中也有同樣的趨勢(shì)（圖3c）。CAF外泌體與GC細(xì)胞共培養(yǎng)，6h時(shí)在SGC7901細(xì)胞和MKN45細(xì)胞中均檢測(cè)到PKH-26 標(biāo)記的CAF外泌體（圖3d），表明CAFs來(lái)源的外泌體能與GC細(xì)胞有效融合。CAFs外泌體顯著抑制了GC細(xì)胞中ALOX15的表達(dá)（圖3e-g）。此外，exo-miR-522被證明能有效抑制erastin誘導(dǎo)的GC細(xì)胞脂質(zhì)ROS積聚和鐵死亡（圖3h，3i）。erastin處理的SGC7901細(xì)胞線粒體膜電位明顯升高（圖3j），CAF外泌體部分逆轉(zhuǎn)了erastin對(duì)線粒體的損傷（圖3k）?？傊?，CAFs分泌的外泌體miR-522抑制ALOX15的表達(dá)，下調(diào)GC細(xì)胞的鐵死亡水平。

4）USP7通過(guò)穩(wěn)定hnRNPA1促進(jìn)miR-522的分泌
    在目前的研究中，hnRNPA1在胃腫瘤組織中上調(diào)。IHC分析顯示了USP7、HNNPA1和ALOX15之間的相關(guān)性（圖4a）。接下來(lái)，我們檢測(cè)發(fā)現(xiàn)上述12種腫瘤組織的hnRNPA1和USP7在CAFs中高表達(dá)（圖4b-d）。此外，hnRNPA1和USP7水平與外泌體miR-522呈正相關(guān)（圖4e，4f），提示USP7和hnRNPA1參與CAFs miR-522分泌。此外，與去泛素相關(guān)的USP7在增加HRNPA1水平方面起著重要作用（圖4g）。
    為了進(jìn)一步研究USP7、hnRNPA1和miR-522之間的內(nèi)在聯(lián)系，我們構(gòu)建了包含hnRNPA1和USP7編碼序列的質(zhì)粒以及兩個(gè)基因的siRNAs。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染顯著上調(diào)了hnRNPA1和USP7的表達(dá)，而siRNAs的應(yīng)用導(dǎo)致了這兩個(gè)基因的顯著減少（圖4h，4i）。在CAFs中，hnRNPA1或USP7的過(guò)表達(dá)促進(jìn)外泌體miR-522的表達(dá)；然而，這兩個(gè)基因的敲除相對(duì)降低了外泌體miR-522的水平（圖4j）。拯救實(shí)驗(yàn)表明，過(guò)表達(dá)的hnRNPA1或USP7部分中和了各自siRNAs對(duì)exo-miR-522的影響（圖4h-j）。接下來(lái)，在免疫沉淀法的產(chǎn)物中，可以使用抗hnRNPA1抗體檢測(cè)USP7，反之亦然（圖4k）。此外，USP7與HRNA1泛素化水平之間呈負(fù)相關(guān)（圖4l）。總之，這些結(jié)果表明USP7通過(guò)去泛素化穩(wěn)定了CAFs中的hnRNPA1，從而增強(qiáng)了外泌體miR-522的分泌。

5）hnRNPA1直接介導(dǎo)CAF中外泌體miR-522
    為了進(jìn)一步驗(yàn)證hnRNPA1選擇性地將miR-522包裝成外泌體中的作用，我們利用RBPDB預(yù)測(cè)了miR522結(jié)合蛋白的表達(dá)。圖5a顯示了前三個(gè)RNA結(jié)合蛋白，hnRNPA1得分最高。我們?cè)O(shè)計(jì)了PABPC1和ACO1 siRNAs，PABPC1和ACO1明顯被siRNAs敲除（圖5b）。這些siRNAs的轉(zhuǎn)染對(duì)CAFs中miR-522的表達(dá)幾乎沒(méi)有影響（圖5c），但是hnRNPA1的下調(diào)顯著降低了CAF外泌體miR-522的水平（圖5d）。用生物素標(biāo)記野生型和突變miR-522，轉(zhuǎn)染CAFs。結(jié)果表明，在使用野生型生物素miR-522產(chǎn)生co-IP時(shí)，只檢測(cè)到hnRNPA1（圖5e）。另外，Cy3標(biāo)記的miR522被轉(zhuǎn)染到CAFs中，來(lái)自CAFs的外泌體通過(guò)細(xì)胞膜與較低的GC細(xì)胞融合。Cys-miR-522在SGC7901細(xì)胞和MKN45細(xì)胞中均能清楚地被檢測(cè)到，并且在CAFs中hnRNPA1的沉默阻止了Cys-miR-522從CAFs向GC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移（圖5h-k）。這些數(shù)據(jù)表明hnRNPA1在miR-522進(jìn)入CAF外泌體的過(guò)程中起著重要的中介作用。

6）化學(xué)毒性通過(guò)激活USP7/hnRNPA1途徑促進(jìn)CAFs分泌miR-522
    為了獲得CAFs化療誘導(dǎo)的損傷反應(yīng)，我們檢測(cè)了用亞致死劑量順鉑或紫杉醇治療的GC細(xì)胞。順鉑和紫杉醇對(duì)CAFs細(xì)胞活力的抑制作用如圖6a，6b所示。選用8μg/mL順鉑和100 nmol/L紫杉醇作為CAFs的亞致死劑量。結(jié)果表明，順鉑或紫杉醇均能促進(jìn)CAFs中USP7和hnRNPA1的表達(dá)（圖6c和d）；化療毒性也增強(qiáng)了hnRNPA1的去泛素化（圖6e和f），從而導(dǎo)致miR-522在外泌體中的表達(dá)上調(diào)，而對(duì)原發(fā)性CAFs中miR-522的表達(dá)無(wú)明顯影響（圖6g）。這一結(jié)果表明，化療通過(guò)增加USP7的表達(dá)和減少hnRNPA1的泛素化，促進(jìn)外泌體miR-522分泌。
    從經(jīng)順鉑或紫杉醇處理的CAF中分離的外泌體與GC細(xì)胞共培養(yǎng)結(jié)果看，它們顯示出比對(duì)照CAF外泌體更大的抑制ALOX15蛋白表達(dá)的能力，而不影響ALOX15轉(zhuǎn)錄（圖6h-j）。在SGC7901和MKN45細(xì)胞中，順鉑處理的CAF外泌體和紫杉醇處理的CAF外泌體均能更有效地減少脂質(zhì)ROS的產(chǎn)生并抑制erastin誘導(dǎo)的鐵死亡（圖6k，6l）。在培養(yǎng)基中加入順鉑可導(dǎo)致GC細(xì)胞的高死亡率，而順鉑處理的CAF外泌體和紫杉醇處理的CAF外泌體可降低GC細(xì)胞的死亡率（圖6m）。這些體外實(shí)驗(yàn)為CAF外泌體在化療過(guò)程中降低藥物敏感性提供了證據(jù)。

7）USP7/hnRNPA1/miR-522對(duì)胃癌生長(zhǎng)及化療敏感性的體內(nèi)調(diào)節(jié)作用
    在體內(nèi)評(píng)價(jià)USP7/hnRNPA1/miR-522軸對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和化療療效的影響。我們用含有shRNAs的慢病毒分別產(chǎn)生了三株敲除USP7、hnRNPA1和miR-522的胃成纖維細(xì)胞株，并將這些成纖維細(xì)胞株與SGC7901細(xì)胞混合用于小鼠皮下腫瘤移植（圖7a）。從第10天開(kāi)始，每5天給這些荷瘤小鼠注射順鉑或生理鹽水，第30天取出腫瘤。CAFs中USP7、hnRNPA1或miR-522的敲除明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)，增強(qiáng)對(duì)順鉑的敏感性（圖7b-d），但腫瘤中脂質(zhì)ROS水平上調(diào)（圖7e）。另外，USP7的敲除降低了hnRNPA1蛋白水平；CAF中三個(gè)基因的抑制導(dǎo)致癌細(xì)胞中ALOX15的上調(diào)（圖7f-h）。此外，順鉑的治療相對(duì)促進(jìn)了CAFs中USP7/hnRNPA1和癌細(xì)胞中ALOX15的表達(dá)（圖7f-h），但ALOX15的mRNA變化不大（圖7i）。從這些小鼠中分離出血漿外泌體（圖7j），外泌體miR-522在USP7-KD和hnRNPA1-KD組中水平急劇下降，在miR-522-KD組中最低（圖7k）。細(xì)胞凋亡標(biāo)志物CASP3在CAFs中隨USP7、hnRNPA1和miR-522基因敲除而略有升高（圖7l-m）。綜上所述，這些結(jié)果表明USP7/hnRNPA1促進(jìn)CAFs分泌exo-miR-522，降低腫瘤中脂質(zhì)ROS水平，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。此外，通過(guò)阻斷miR-522的分泌，可以提高化療藥物的療效。

8）USP7/hnRNPA1/exo-miR-522通路對(duì)腫瘤移植小鼠生存的影響
    USP7、hnRNPA1和miR522的抑制延長(zhǎng)了荷瘤小鼠的生存期（圖8a），而順鉑組小鼠的存活率高于生理鹽水組（圖8b）。最后，我們提供了一個(gè)示意圖來(lái)說(shuō)明跨細(xì)胞信號(hào)通路在調(diào)控GC細(xì)胞鐵依賴性中的生物學(xué)作用，包括USP7、HRNPA1、exo-miR-522和ALOX15（圖8c）。

結(jié) 論：
    CAFs通過(guò)靶向ALOX15和阻斷脂質(zhì)ROS的積累，分泌外泌體miR-522抑制癌細(xì)胞的鐵死亡。由USP7、hnRNPA1、exo-miR-522和ALOX15組成的細(xì)胞間通路揭示了GC中獲得性耐藥的新機(jī)制。