CircSHKBP1——一種很有前途的胃癌診斷和預(yù)后的循環(huán)生物標(biāo)志物
CircRNAs在多種癌癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要的調(diào)控作用。然而，circRNAs在胃癌（GC）中的生物學(xué)功能及其分子機(jī)制尚不清楚。circRNAs是一類由反分裂產(chǎn)生的ncRNA，其環(huán)結(jié)構(gòu)使其更加穩(wěn)定。研究表明，circRNAs在外泌體中穩(wěn)定富集。外泌體是大多數(shù)細(xì)胞分泌的納米級(jí)胞外囊泡，含有豐富的RNA和蛋白質(zhì)，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)過程，作為鑒定多種疾病的循環(huán)生物標(biāo)志物，已證實(shí)血清外泌體circRNA能將癌癥患者與健康對(duì)照者區(qū)分開來，外泌體circRNA可以作為液體活檢的生物標(biāo)志物。在這項(xiàng)研究中，作者發(fā)現(xiàn)circSHKBP1在GC患者的腫瘤和血清外泌體中都高表達(dá)，且與晚期病理分期和較差的生存率有關(guān)。CircSHKBP1通過海綿化miR-582-3p和誘導(dǎo)HSP90(熱休克蛋白90）促進(jìn)體內(nèi)外GC進(jìn)展，為GC的發(fā)病機(jī)制提供了新的研究視角。
技術(shù)路線：
1.CircSHKBP1證實(shí)可以作為GC RNA的生物標(biāo)志物
通過qRT-PCR分析，circSHKBP1是GC中表達(dá)最差的cir-cRNA，來自血清外泌體的circSHKBP1在GC患者中表達(dá)更為豐富。另外分析胃切除術(shù)（R0切除）前后血清中circSHKBP1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)腫瘤切除后，circSHKBP1急劇下降，這表明GC組織是外泌體circSHKBP1的起源，證實(shí)circSHKBP1是一種來源于GC組織的上調(diào)的circRNA，可以通過外泌體有效地傳遞到循環(huán)中。此外，circSHKBP1的高表達(dá)與胃癌的晚期TNM分期和預(yù)后差有關(guān)，是一種潛在的GC RNA生物標(biāo)志物。
2.CircSHKBP1調(diào)控GC的生物學(xué)功能
circSHKBP1在4種人胃癌細(xì)胞系（BGC823、HGC27、AGS和MGC803）和正常胃上皮細(xì)胞系GES1中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，其中在BGC823和HGC27過表達(dá)。CircSHKBP1促進(jìn)GC細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，而沉默circSHKBP1的表達(dá)則抑制GC細(xì)胞的發(fā)育。更重要的是，隨著circSHKBP1在GC細(xì)胞中的異位表達(dá)，更多的circSHKBP1被裝載到外泌體中，從而干擾GC細(xì)胞的生物學(xué)功能。
圖2 CircSHKBP1在體外促進(jìn)GC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲
3.CircSHKBP1在GC中的作用機(jī)制
FISH分析和qRT-PCR分析表明，circSHKBP1優(yōu)先定位于GC細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。miR-582-3p被預(yù)測(cè)與circhKBP1結(jié)合，且經(jīng)過試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)circSHKBP1降低miR-582-3p的表達(dá)。CCK8和Transwell分析表明miR-582-3p模擬物抑制了GC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，而circSHKBP1的過度表達(dá)消除了這種對(duì)GC細(xì)胞發(fā)育的抑制作用。
圖3 CircSHKBP1可用作miR-582-3p的海綿。
4.CirchKBP1通過上調(diào)HUR促進(jìn)VEGF分泌并誘導(dǎo)血管生成
通過生物信息學(xué)分析網(wǎng)站（TargetScan、TargetMiner和miRDB），發(fā)現(xiàn)了54個(gè)miR-582-3p候選靶蛋白，其中HUR和EIF2S1被作為VEGF信號(hào)通路的一部分。檢測(cè)GC組織中HUR mRNA的水平發(fā)現(xiàn)HUR的表達(dá)與miR-582-3p呈負(fù)相關(guān)，而與circSHKBP1呈正相關(guān)。不同濃度的貝伐單抗（一種抗VEGF的抗體）處理circhKBp1過度表達(dá)的GC細(xì)胞，貝伐單抗以濃度依賴的方式處理GC細(xì)胞增殖和遷移能力減弱，試管形成試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)貝伐單抗可抑制CirchKBP1促進(jìn)VEGF分泌并誘導(dǎo)血管生成的過程。
圖4 CircSHKBP1通過上調(diào)HUR促進(jìn)VEGF翻譯
5.CircSHKBP1直接與HSP90相互作用并抑制其降解
RIP分析顯示circhHKBP1同差異表達(dá)的蛋白質(zhì)HSP90存在直接相互作用的關(guān)系。western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HSP90的降解被抑制，通過泛素連接酶STUB1抑制HSP90的泛素化。而后通過CCK8法、Transwell法評(píng)估發(fā)現(xiàn)circSHKBP1促進(jìn)GC的發(fā)育。
圖5 CircSHKBP1與HSP90直接相互作用并抑制其降解
6.CircSHKBP1對(duì)體內(nèi)GC生長(zhǎng)起促進(jìn)作用
通過慢病毒轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞，構(gòu)建了具有穩(wěn)定沉默的circSHKBP1的LV3-sh1和BGC823-LV3-sh2細(xì)胞株以及穩(wěn)定過表達(dá)circSHKBP1的LV5circSHKBP1細(xì)胞系。體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)circSHKBP1基因敲除可以限制腫瘤的生長(zhǎng)，此外，貝伐單抗顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。western blot分析發(fā)現(xiàn)與LV3-NC組相比，LV3-sh1和LV3-sh2組的HUR和VEGF水平降低；與LV5-NC組相比，LV5-CirchKBP1組的HUR和VEGF增加，而VEGF被貝伐單抗抑制，腫瘤組織中HUR和VEGF的IHC結(jié)果相似。qRT-PCR分析circSHKBP1表達(dá)發(fā)現(xiàn)外泌體circSHKBP1的表達(dá)與癌組織circhkbp1的表達(dá)呈線性關(guān)系，證實(shí)了circSHKBP1可以通過外泌體傳遞到遠(yuǎn)端，且在循環(huán)中可被檢測(cè)到。腫瘤中miR-582-3p的表達(dá)水平與circSHKBP1呈負(fù)相關(guān)。此外，腫瘤中CD31的IF顯示貝伐單抗有效地抑制了circshKB1誘導(dǎo)的血管生成。
圖6 CircSHKBP1促進(jìn)體內(nèi)GC生長(zhǎng)
7.CircSHKBP1在體內(nèi)GC轉(zhuǎn)移起促進(jìn)作用
研究circSHKBP1在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移潛能發(fā)現(xiàn)，circSHKBP1基因敲除顯著減少了肺轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量和大小。此外，circSHKBP1基因敲除導(dǎo)致GC肺轉(zhuǎn)移病灶中HUR和VEGF染色明顯降低，circSHKBP1的過度表達(dá)加重了肺轉(zhuǎn)移病灶，HUR和VEGF染色增加，且貝伐單抗也能抑制circSHKBP1的轉(zhuǎn)移潛能。
圖7 CircSHKBP1促進(jìn)體內(nèi)GC轉(zhuǎn)移
參考文獻(xiàn)：
Xie Mengyan,Yu Tao,Jing Xinming et al. Exosomal circSHKBP1 promotes gastric cancer progression via regulating the miR-582-3p/HUR/VEGF axis and suppressing HSP90 degradation.[J].Mol. Cancer, 2020, 19: 112.