2.CircSHKBP1調(diào)控GC的生物學(xué)功能
circSHKBP1在4種人胃癌細(xì)胞系(BGC823、HGC27、AGS和MGC803)和正常胃上皮細(xì)胞系GES1中的表達(dá)發(fā)現(xiàn),其中在BGC823和HGC27過表達(dá)。CircSHKBP1促進(jìn)GC細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移,而沉默circSHKBP1的表達(dá)則抑制GC細(xì)胞的發(fā)育。更重要的是,隨著circSHKBP1在GC細(xì)胞中的異位表達(dá),更多的circSHKBP1被裝載到外泌體中,從而干擾GC細(xì)胞的生物學(xué)功能。
圖2 CircSHKBP1在體外促進(jìn)GC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲
3.CircSHKBP1在GC中的作用機(jī)制
FISH分析和qRT-PCR分析表明,circSHKBP1優(yōu)先定位于GC細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。miR-582-3p被預(yù)測與circhKBP1結(jié)合,且經(jīng)過試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)circSHKBP1降低miR-582-3p的表達(dá)。CCK8和Transwell分析表明miR-582-3p模擬物抑制了GC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,而circSHKBP1的過度表達(dá)消除了這種對(duì)GC細(xì)胞發(fā)育的抑制作用。
圖3 CircSHKBP1可用作miR-582-3p的海綿。
4.CirchKBP1通過上調(diào)HUR促進(jìn)VEGF分泌并誘導(dǎo)血管生成
通過生物信息學(xué)分析網(wǎng)站(TargetScan、TargetMiner和miRDB),發(fā)現(xiàn)了54個(gè)miR-582-3p候選靶蛋白,其中HUR和EIF2S1被作為VEGF信號(hào)通路的一部分。檢測GC組織中HUR mRNA的水平發(fā)現(xiàn)HUR的表達(dá)與miR-582-3p呈負(fù)相關(guān),而與circSHKBP1呈正相關(guān)。不同濃度的貝伐單抗(一種抗VEGF的抗體)處理circhKBp1過度表達(dá)的GC細(xì)胞,貝伐單抗以濃度依賴的方式處理GC細(xì)胞增殖和遷移能力減弱,試管形成試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)貝伐單抗可抑制CirchKBP1促進(jìn)VEGF分泌并誘導(dǎo)血管生成的過程。
圖4 CircSHKBP1通過上調(diào)HUR促進(jìn)VEGF翻譯
5.CircSHKBP1直接與HSP90相互作用并抑制其降解
RIP分析顯示circhHKBP1同差異表達(dá)的蛋白質(zhì)HSP90存在直接相互作用的關(guān)系。western blot法檢測發(fā)現(xiàn)HSP90的降解被抑制,通過泛素連接酶STUB1抑制HSP90的泛素化。而后通過CCK8法、Transwell法評(píng)估發(fā)現(xiàn)circSHKBP1促進(jìn)GC的發(fā)育。
圖5 CircSHKBP1與HSP90直接相互作用并抑制其降解
6.CircSHKBP1對(duì)體內(nèi)GC生長起促進(jìn)作用
通過慢病毒轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞,構(gòu)建了具有穩(wěn)定沉默的circSHKBP1的LV3-sh1和BGC823-LV3-sh2細(xì)胞株以及穩(wěn)定過表達(dá)circSHKBP1的LV5circSHKBP1細(xì)胞系。體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)circSHKBP1基因敲除可以限制腫瘤的生長,此外,貝伐單抗顯著抑制腫瘤生長。western blot分析發(fā)現(xiàn)與LV3-NC組相比,LV3-sh1和LV3-sh2組的HUR和VEGF水平降低;與LV5-NC組相比,LV5-CirchKBP1組的HUR和VEGF增加,而VEGF被貝伐單抗抑制,腫瘤組織中HUR和VEGF的IHC結(jié)果相似。qRT-PCR分析circSHKBP1表達(dá)發(fā)現(xiàn)外泌體circSHKBP1的表達(dá)與癌組織circhkbp1的表達(dá)呈線性關(guān)系,證實(shí)了circSHKBP1可以通過外泌體傳遞到遠(yuǎn)端,且在循環(huán)中可被檢測到。腫瘤中miR-582-3p的表達(dá)水平與circSHKBP1呈負(fù)相關(guān)。此外,腫瘤中CD31的IF顯示貝伐單抗有效地抑制了circshKB1誘導(dǎo)的血管生成。
圖6 CircSHKBP1促進(jìn)體內(nèi)GC生長
7.CircSHKBP1在體內(nèi)GC轉(zhuǎn)移起促進(jìn)作用
研究circSHKBP1在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移潛能發(fā)現(xiàn),circSHKBP1基因敲除顯著減少了肺轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量和大小。此外,circSHKBP1基因敲除導(dǎo)致GC肺轉(zhuǎn)移病灶中HUR和VEGF染色明顯降低,circSHKBP1的過度表達(dá)加重了肺轉(zhuǎn)移病灶,HUR和VEGF染色增加,且貝伐單抗也能抑制circSHKBP1的轉(zhuǎn)移潛能。
圖7 CircSHKBP1促進(jìn)體內(nèi)GC轉(zhuǎn)移
參考文獻(xiàn):
Xie Mengyan,Yu Tao,Jing Xinming et al. Exosomal circSHKBP1 promotes gastric cancer progression via regulating the miR-582-3p/HUR/VEGF axis and suppressing HSP90 degradation.[J].Mol. Cancer, 2020, 19: 112.