外泌體的分離和統(tǒng)計(jì)你知道多少？

    外泌體是直徑為30-150 nm的小細(xì)胞外囊泡。多年以來，外泌體被認(rèn)為是細(xì)胞成熟過程中產(chǎn)生的“垃圾”。然而，隨著最近從不同類型的外泌體中分離出各種蛋白質(zhì)，脂質(zhì)和遺傳物質(zhì)（例如，miRNA，mRNA，DNA分子以及lncRNA），它們?cè)诩?xì)胞通訊和表觀遺傳調(diào)控中的關(guān)鍵作用已經(jīng)顯現(xiàn)。在生理和病理?xiàng)l件下，幾乎所有類型的細(xì)胞都可以釋放外泌體，這些外泌體通過轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵蛋白和遺傳物質(zhì)（例如miRNA，mRNA和DNA）在細(xì)胞通訊和表觀遺傳調(diào)控中發(fā)揮重要作用。目前，在Clinicaltrials.gov上注冊(cè)了127種與外泌體相關(guān)的臨床試驗(yàn)（2017年為26項(xiàng)試驗(yàn)），涉及多種疾病的治療和診斷。因此，已經(jīng)深入研究了基于外泌體的疾病診斷和治療方法。Dongbin Yang團(tuán)隊(duì)所在的多個(gè)中國(guó)醫(yī)院與澳大利亞和美國(guó)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)及研究中心于2020.02.19聯(lián)合發(fā)表于Theranostics（ 影響因子:8.063）的一篇文章，通過全面分析外泌體分離策略的進(jìn)展，詳細(xì)介紹了，當(dāng)前外泌體分離技術(shù)的全景視圖，為從各種類型的生物基質(zhì)中高效分離外泌體的新型方法的發(fā)展提供了前景。此外，從基于外泌體的診斷和治療的角度來看，作者強(qiáng)調(diào)定量外泌體和微囊泡分離的問題。

1.差速超離心法分離外泌體的示意圖
    差速超離心法是利用離心力從300×g到100,000×g的多個(gè)離心循環(huán)來實(shí)現(xiàn)的。每離心一步后，除去細(xì)胞、細(xì)胞碎片、凋亡小體等微丸，收集上清進(jìn)行離心。在最后離心后(即除去上清，收集外泌體含球團(tuán)和污染蛋白。離心在4℃下進(jìn)行。

2.梯度超離心法分離外泌體的示意圖
    (A)等密度梯度超離心法是通過在從底部到頂部逐漸降低的層中添加介質(zhì)來制備的。長(zhǎng)時(shí)間離心后，細(xì)胞外成分包括外泌體、凋亡小體和蛋白聚集物在密度相近的培養(yǎng)基中達(dá)到靜止位置。然而，由于等密度梯度超離心僅依賴于樣品中不同溶質(zhì)之間的密度差，該方法不能分離與外泌體具有類似浮力密度的物質(zhì)(如微泡)。(B)移動(dòng)帶梯度超離心法通常包括兩個(gè)梯度介質(zhì)段。最上層是密度低于樣品所有溶質(zhì)的介質(zhì)。底部是高密度的墊子。由于溶質(zhì)的密度都大于梯度介質(zhì)的密度，離心后，不僅根據(jù)密度，而且根據(jù)質(zhì)量/大小，將所有溶質(zhì)依次分離，從而可以分離密度相當(dāng)?shù)笮〔灰坏男∨荨?br/>

3.超濾法分離外泌體的示意圖
    （A）串聯(lián)配置的微過濾器。細(xì)胞外液通過串聯(lián)配置的微濾器，其尺寸排阻極限在20-200 nm附近。當(dāng)穿過兩個(gè)膜時(shí)，包括細(xì)胞碎片，凋亡小體和大部分微囊的大囊泡被捕獲在200nm膜中,而直徑20至200nm的囊泡則保留在下部20nm濾膜上。（B）順序超濾。首先將細(xì)胞外液通過1000納米過濾器以除去較大的顆粒（例如細(xì)胞或細(xì)胞碎片）；然后將濾液通過截留值為500kD的第二個(gè)過濾器，以除去小顆粒，例如游離蛋白。最后，通過200nm濾光片收集<200nm的外泌體。

4.切向流過濾確保高效的超濾示意圖
    在切向流過濾期間，進(jìn)料流平行于膜面流動(dòng)。所施加的壓力使一部分氣流根據(jù)過濾器的尺寸通過膜。由于膜始終在平行流動(dòng)力的作用下，可以有效地減少潛在的堵塞。在切向流過濾過程中，將剩余部分重新循環(huán)回給料池以進(jìn)行重復(fù)過濾，以確保徹底過濾。

5.體積排阻色譜的外泌體分離原理
    當(dāng)溶液通過由多孔樹脂顆粒組成的固定相時(shí)，分子可以根據(jù)尺寸（A）進(jìn)行分離；雖然流體動(dòng)力學(xué)半徑小于固定相孔的顆粒進(jìn)入孔中以獲取更長(zhǎng)的傳輸距離，但無法進(jìn)入孔中的較大顆粒直接在樹脂（B）周圍移動(dòng)。這導(dǎo)致具有不同尺寸的顆粒表現(xiàn)出不同的保留時(shí)間，因此有利于基于尺寸的分離。

6.聚合物沉淀策略示意圖
    在將高親水性聚合物添加到含外泌體的溶液中后，外泌體周圍的水分子被聚合物束縛，降低了外泌體的溶解度并誘導(dǎo)其隨后的沉淀。低速離心可以很容易地收集外泌體。

7.水兩相系統(tǒng)的外泌體分離示意圖
    當(dāng)將疏水性更高的聚乙二醇（PEG）和親水性更高的葡聚糖溶液混合時(shí)，可能會(huì)發(fā)生兩相系統(tǒng)。將PEG和右旋糖酐添加到含外泌體的溶液中，然后進(jìn)行孵育和低速離心后，蛋白質(zhì)和其他大分子復(fù)合物優(yōu)先聚集在PEG中，而外泌體優(yōu)先聚集在右旋糖酐相中。

8.基于免疫親和力的外來體分離示意圖
    首先，將識(shí)別外泌體特異性標(biāo)志物的抗體固定在固體基質(zhì)上。用抗體偶聯(lián)的固體基質(zhì)孵育含外泌體的液體后，可將外泌體富集到此類固體基質(zhì)上。可以通過額外的洗脫步驟收集游離的外來體。

9.適體介導(dǎo)的免疫親和力
    適體通過構(gòu)象互補(bǔ)識(shí)別并結(jié)合其靶標(biāo)。在調(diào)整了緩沖系統(tǒng)的關(guān)鍵因素（如鹽類型和離子強(qiáng)度）之后，適體的形狀發(fā)生變化并釋放結(jié)合的靶分子。

10.集成的微流技術(shù)可實(shí)現(xiàn)結(jié)合的外泌體分離和分析
    在將含有外泌體的液體添加到鞘層介質(zhì)中之后，可以基于細(xì)胞外囊泡的物理和生化特性，通過不同的方法分離包括外泌體的液體中的顆粒。重要的是，在信號(hào)檢測(cè)平臺(tái)的幫助下，這些小型化的微流控設(shè)備不僅實(shí)現(xiàn)了從少量體液中快速隔離外來體，而且還可以進(jìn)行實(shí)時(shí)外來體表征以進(jìn)行原位診斷。

11.納米線的外泌體脫扣系統(tǒng)的原理
    （A）與基于SEC的分離類似，可以通過在均勻分離的微柱壁上壓印含多孔硅的納米線，創(chuàng)建微柱上的納米線結(jié)構(gòu)。在將含外泌體的液體添加到微柱上的納米線分層結(jié)構(gòu)后，液體中的顆粒會(huì)經(jīng)歷不同的命運(yùn)；（1）直接從亞微米微柱陣列中排除較大的顆粒（例如細(xì)胞）；（2）具有亞微米尺寸（例如，細(xì)胞碎片）的顆粒能夠進(jìn)入微柱間隔，但無法進(jìn)入30-200 nm納米線間隔；（3）小分子（例如蛋白質(zhì)）在納米線間隔內(nèi)移動(dòng)而不受阻礙；（4） 30–200 nm的粒子（例如外泌體）被納米線森林所阻擋。（B）具有不同尺寸的顆粒呈現(xiàn)不同的保留時(shí)間，因此有利于尺寸依賴性分離。

12.非接觸式微流控技術(shù)簡(jiǎn)化了外泌體分離程序
    （A）在基于粘彈性介質(zhì)流的微流系統(tǒng)中，含囊泡的流體（從inlet 1添加）遇到鞘流（從inlet 2添加），并首先沿微通道壁對(duì)齊。在施加由流體的粘彈性產(chǎn)生的彈性提升力后，外泌體和其他細(xì)胞外成分會(huì)根據(jù)其大小被驅(qū)向微通道的中心線，較大的顆粒最終會(huì)到達(dá)中心線。 （B）在超聲波的壓力下，具有不同機(jī)械性能（例如，可壓縮性，尺寸和密度）的顆粒經(jīng)受不同的輻射力，并導(dǎo)致連續(xù)地?zé)o接觸且依賴尺寸的外泌體分離。

13.細(xì)胞外囊泡主要由兩種具有相似理化特性的囊泡組成
     細(xì)胞外囊泡包括外泌體和微囊泡。它們之間的主要區(qū)別在于它們的亞細(xì)胞起源。微囊泡是從細(xì)胞膜上脫落50-1000 nm的顆粒。外泌體是源自內(nèi)體的30–150 nm細(xì)胞外囊泡，它們?cè)诩?xì)胞膜和多囊體融合后通過胞吐作用分泌到體液中。由于缺乏有效的策略來分離微泡和外泌體，仍然很難精確評(píng)估其理化性質(zhì)和功能。

14.通過囊泡和微囊泡標(biāo)記物特異性抗體計(jì)算胞外囊泡的囊泡和微囊泡組分的比例
    細(xì)胞外囊泡A（A’）通過聚合物沉淀濃縮。然后使用相應(yīng)的基于抗體的免疫親和捕獲法提取外泌體（B）或微囊泡（B'）；洗脫后，使用基于抗體的免疫親和方法從洗脫液中再次提取外泌體（C’）和微泡（C）。然后，對(duì)提取的外泌體（B，C'）和微囊泡（B'，C）進(jìn)行定量。使用D中所示的公式計(jì)算原始細(xì)胞外囊泡中外泌體和微囊泡的比例。

參考文獻(xiàn)：
       Yang Dongbin,Zhang Weihong,Zhang Huanyun et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.[J] .Theranostics, 2020, 10: 3684-3707.