自噬依賴性鐵死亡驅(qū)動腫瘤相關(guān)巨噬細胞極化
導(dǎo) 語：
腫瘤微環(huán)境（TME）：由惡性腫瘤細胞、免疫細胞和其他成分組成的動態(tài)網(wǎng)絡(luò)，影響著癌癥的發(fā)展和治療。設(shè)計針對腫瘤微環(huán)境TME內(nèi)癌細胞與周圍免疫細胞之間的相互作用信號和分子的新型抗癌藥是腫瘤治療的熱點。腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAM）是招募入腫瘤微環(huán)境TME的骨髓源性免疫細胞。自噬是體內(nèi)的一種穩(wěn)態(tài)機制，在腫瘤生物學(xué)中起作用。自噬依賴性鐵死亡與巨噬細胞的極化有何聯(lián)系，今天，我們先睹為快。
技術(shù)路線:
結(jié) 果:
1. 癌細胞自噬依賴性鐵毒性死亡期間，釋放KRASG12D到細胞外
PDAC的啟動和發(fā)展與氧化應(yīng)激有關(guān)。H2O2誘導(dǎo)兩種人類PDAC細胞系PANC1、AsPC1細胞以及原代人PDAC細胞釋放KRASG12D，H2O2引起的細胞死亡和釋放KRASG12D（圖1C）可被自噬抑制劑阻斷，但凋亡抑制劑或壞死性凋亡抑制劑沒有此效應(yīng)。凋亡抑制劑Z-VAD-FMK有效阻止星形孢菌素引起的死亡，壞死抑制劑阻止了PANC1細胞中的TNF+ Z-VAD-FMK +放線菌酮的致死效應(yīng)。此外，敲除自噬相關(guān)基因抑制H2O2誘導(dǎo)的細胞死亡和KRASG12D釋放，表明自噬依賴性細胞死亡促進氧化應(yīng)激期間KRASG12D蛋白的釋放。研究表明自噬依賴性細胞死亡是一種獨特的脂質(zhì)過氧化介導(dǎo)的死亡。鐵死亡抑制劑阻止H2O2誘導(dǎo)的自噬體標記MAP1LC3B形成、細胞死亡和KRASG12D釋放。鐵死亡誘導(dǎo)劑效果相反。這些表明，鐵死亡可導(dǎo)致PDAC細胞釋放KRASG12D蛋白。
2. 巨噬細胞攝取外泌體KRASG12D需要AGER
外泌體是內(nèi)體來源的細胞外囊泡，氧化應(yīng)激和細胞死亡過程中介導(dǎo)細胞間通訊。在PANC1和AsPC1細胞分離外泌體，外泌體大小為50-150 nm，表達外泌體陽性標記，但不表達陰性標記。外泌體中KRASG12D蛋白增加，氯喹、敲低ATG5和ferrostatin-1阻斷外泌體中H2O2誘導(dǎo)的KRASG12D蛋白積累。外泌體生物抑制劑GW4869和RAB27A抑制PANC1細胞釋放KRASG12D。絕大多數(shù)1萬或10萬離心后的沉淀是外泌體，觀察到KRASG12D存在于10K或100K離心后的蛋白質(zhì)顆粒。這些發(fā)現(xiàn)表明自噬依賴鐵死亡導(dǎo)致含KRASG12D的外泌體釋放。
人外周血單核細胞衍生的巨噬細胞（PBMCM）通常不含KRASG12D，但以時間依賴性方式攝取H2O2誘導(dǎo)的腫瘤外泌體，提示腫瘤KRASG12D可以進入巨噬細胞。用H2O2誘導(dǎo)的癌癥外泌體培養(yǎng)PBMCM，抗AGER抗體或敲低AGER，抑制PBMCM吸收KRASG12D。這些發(fā)現(xiàn)表明AGER介導(dǎo)巨噬細胞攝取KRASG12D。
3. KRASG12D通過STAT3依賴性脂肪酸氧化促進巨噬細胞M2極化
PBMCM中過表達KRASG12D，M1分化生物標志物上調(diào)，H2O2誘導(dǎo)的癌癥外泌體也增加PBMCM的M2標記表達，表明攝取KRASG12D可能會導(dǎo)致致癌的M2極化。脂肪酸氧化可促進M2巨噬細胞極化。過表達KRASG12D或 H2O2誘導(dǎo)的的癌癥外泌體可增加PBMCM中的脂肪酸氧化，該過程被敲低AGER所抑制，加入脂肪酸氧化藥理抑制劑課抑制M2極化。以上表明，脂肪酸氧化有助于KRASG12D介導(dǎo)的M2巨噬細胞極化。p-STAT3在過表達KRASG12D或癌癥外泌體處理的PBMCM中被上調(diào)，STAT3磷酸化被敲低AGER抑制。敲低STAT3減少PBMCM細胞脂肪酸氧化和M2巨噬細胞極化。由此可見，KRASG12D誘導(dǎo)的脂肪酸氧化和M2極化需要AGER介導(dǎo)的STAT3激活。脂肪酸氧化代謝途徑的基因CPT1A和ACADM在過表達KRASG12D的PBMCM中上調(diào)，該作用被AGER或STAT3的敲低所抑制。以上結(jié)果表明，AGER-STAT3途徑對于KRASG12D誘導(dǎo)的脂肪酸氧化和隨后的巨噬細胞M2極化至關(guān)重要。
4. 阻斷KRASG12D的釋放和攝取可抑制巨噬細胞介導(dǎo)的胰腺腫瘤體內(nèi)生長
利用免疫缺陷的NOD SCID小鼠建立異種移植瘤模型，與單獨PANC1細胞相比，PBMCMs促進胰腺腫瘤的生長，局部注射氯喹，ferrostatin-1或抗AGER抗體抑制PANC1加PBMCM引起的腫瘤生長，PANC1細胞中敲低ATG5或PBMCM中敲低AGER，降低PANC1細胞和PBMCM所產(chǎn)生的腫瘤生長。敲低STAT3，ATG5，CPT1A或RAB27A可令過表達KRASG12D的PBMCMs細胞失去腫瘤促進作用。這些發(fā)明，將KRASG12D或KRASG12D蛋白轉(zhuǎn)移到PBMCM中可驅(qū)動PDAC進展，這一效應(yīng)涉及ATG5，STAT3，CPT1A和RAB27A途徑。
5. 巨噬細胞中高KRASG12D表達與PDAC存活率低有關(guān)
使用59位胰腺癌患者的組織芯片，在CD68 +巨噬細胞中檢測到KRASG12D的表達。CD68 +巨噬細胞高表達KRASG12D的患者（高KRASG12D巨噬細胞組），總體生存率比低KRASG12D巨噬細胞組的患者低。這些表明巨噬細胞對KRASG12D的攝取增加可能與人類胰腺癌進展有關(guān)。
總結(jié)：
1. KRASG12D，一種與損傷相關(guān)的分子模式（DAMP），在氧化應(yīng)激期間從細胞釋放；
2.自噬依賴性的鐵死亡是ROS誘導(dǎo)的PDAC細胞釋放KRASG12D所必須；
3. KRASG12D可通過外泌體從鐵死亡癌細胞傳遞至巨噬細胞；
4. KRASG12D通過STAT3依賴性的脂肪酸氧化激活，促進巨噬細胞極化；
5. KRASG12D轉(zhuǎn)移（從癌細胞轉(zhuǎn)移到巨噬細胞）的藥理和遺傳抑制作用，可抑制巨噬細胞刺激的人PDACs生長。