新靶點(diǎn)！circRNA調(diào)控心肌肥厚
心肌肥厚與正常心功能和受損心功能相關(guān)時(shí)可分為生理和病理兩大類(lèi)。眾所周知，病理性心肌肥厚是心肌梗死、心律失常、心力衰竭甚至猝死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。了解心肌肥厚和向心力衰竭過(guò)渡的分子機(jī)制對(duì)于確定逆轉(zhuǎn)適應(yīng)性心臟重構(gòu)甚至心力衰竭的新靶點(diǎn)至關(guān)重要。本文旨在探究circRNA在心肌肥厚中的調(diào)控作用及機(jī)制，本文于今年1月發(fā)表在Cardiovasc. Res雜志上。
結(jié) 果：
1、CircRNA_000203在Ang-II灌注的小鼠心肌中上調(diào)表達(dá)
建立小鼠心肌肥厚動(dòng)物模型，給予Ang-II灌注4周，體重/脛骨長(zhǎng)度比值(HW/TL)顯著增加(圖1A)。WGA染色結(jié)果顯示Ang-II灌注小鼠心肌細(xì)胞尺寸明顯增大(圖1B)。心肌肥厚小鼠中可觀察到ANP和β-MHC蛋白表達(dá)顯著增加 (圖1 c)。RT-qPCR結(jié)果證實(shí)，在灌注ANG - II的小鼠心肌中，circRNA_000203及其親本基因Myo9a mRNA的表達(dá)一致上調(diào)(圖1D-E)。
圖1 CircRNA_000203在Ang-II灌注的小鼠心肌中上調(diào)表達(dá)
2、CircRNA_000203在Ang-II誘導(dǎo)的NMVCs細(xì)胞中上調(diào)
本文采用ANG - II誘導(dǎo)的NMVC肥大細(xì)胞模型。NMVCs細(xì)胞大小明顯增加，Ang-II-treated NMVCs細(xì)胞中ANP和β-MHC表達(dá)顯著升高 (圖2 a、2 b)。同樣，在ANG - II處理的NMV中，circRNA_000203、Myo9a、Anp和Myh7 mRNA也顯著上調(diào)(圖2C)。circRNA_000203，而不是Myo9a mRNA，對(duì)RNase R處理具有抗性(圖2D)。此外，使用Dactinomycin D抑制RNA轉(zhuǎn)錄，并測(cè)量了Dactinomycin D處理后NMVCs不同時(shí)間點(diǎn)的circRNA_000203和Myo9a mRNA的水平。Dactinomycin D處理后4、8、12 h, circRNA_000203的相對(duì)表達(dá)量明顯高于Myo9a mRNA的表達(dá)量(圖2E)。此外，F(xiàn)ISH和RT-qPCR檢測(cè)顯示，環(huán)狀RNA在NMV中主要分布于細(xì)胞質(zhì) (圖2F, 2G)。
圖2 CircRNA_000203在Ang-II誘導(dǎo)的NMVCs細(xì)胞中上調(diào)
3、CircRNA_000203增強(qiáng)了NMVCs肥厚
本文利用重組circRNA_000203腺病毒rAd-circ203介導(dǎo)過(guò)表達(dá)circRNA_000203在NMV中的表達(dá)。在感染了rAd-circ203的NMVC中，細(xì)胞大小顯著增加(圖3A)。NMVCs中，circRNA_000203而非Myo9a mRNA水平顯著升高，Anp和Myh7 mRNA水平顯著升高(圖3B)。一致,蛋白表達(dá)的ANP和β-MHC也顯著增強(qiáng)執(zhí)行表達(dá)式的NMVCs circRNA_000203(圖3 c)。
圖3 CircRNA_000203增強(qiáng)了NMVCs肥厚
4、過(guò)表達(dá)circRNA_000203可在體內(nèi)加重ANG - II誘導(dǎo)的心肌肥厚
在Tg-circ203小鼠心肌中，circRNA_000203而非Myo9a mRNA高表達(dá)(圖4A)。在本文中，在小鼠體內(nèi)建立了Ang-II灌注4周的肥厚動(dòng)物模型。超聲心動(dòng)圖顯示ANG - II灌注的Tg-circ203小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的變化。加入ANG - II的Tg-circ203小鼠EF和FS顯著降低(圖4B)。此外，WGA染色結(jié)果顯示，加入ANG - II的Tg-circ203小鼠心肌細(xì)胞的大小顯著增加(圖4C)。免疫印跡結(jié)果表明，ANP的表達(dá)和β-MHC也顯著增強(qiáng)心肌的Ang-II-infused Tg-circ203老鼠(圖4 d)。
圖4過(guò)表達(dá)circRNA_000203可在體內(nèi)加重ANG - II誘導(dǎo)的心肌肥厚
5、鑒定miR-26b-5p和miR-140-3p作為circRNA-000203的海綿靶點(diǎn)
序列分析顯示，在circRNA_000203中，miR-26b-5p有兩個(gè)潛在的結(jié)合位點(diǎn)(nt 607 628和nt 702 723)(圖5A)，而miR-140-3p有一個(gè)潛在的結(jié)合位點(diǎn)(nt 964 984)(圖5B)。而miR-26b-5p或miR-140-3p與circRNA_000203的相互作用在相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變后其信號(hào)可以被消除(圖5A, 5B)。過(guò)表達(dá)circRNA_000203的NMV中，miR-26b-5p和miR-140-3p水平顯著降低(圖5C)。RNA下拉和RT-qPCR試驗(yàn)的結(jié)果表明,circRNA_000203下拉的數(shù)量miR-26b-5p-mut明顯低于miR-26b-5p(圖5 d)，和circRNA_000203下拉miR-140-3p-mut也顯著低于miR-140-3p(圖5)。利用生物素標(biāo)記的CircRNA_000203探針從NMVCs裂解液中有效分離出CircRNA_000203(圖5F)。同時(shí)，使用circRNA_000203探針，可以特異性地拉低miR-26b-5p和miR-140-3p，而與miR-144-3p無(wú)關(guān)的miR-144-3p(圖5F)。
圖5鑒定miR-26b-5p和miR-140-3p作為circRNA-000203的海綿靶點(diǎn)
6、MiR-26b-5p和miR-140-3p負(fù)調(diào)控Gata4表達(dá)
在線預(yù)測(cè)miR-26b-5p、miR-140-3p的靶基因，圖6A-B顯示miR-26b-5p、miR-140-3p在Gata4 mRNA的3 -UTRs內(nèi)的結(jié)合位置，并由熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)。與陰性對(duì)照相比，轉(zhuǎn)染miR-26b-5p、-140-3p mimic后，NMV中Gata4的mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低 (圖6C)。如預(yù)期，過(guò)表達(dá)circRNA_000203的NMVC中，Gata4的mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高 (圖6D)。此外，我們還觀察到加入ANG - II的Tg-circ203小鼠心肌的Gata4 mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加 (圖6E)。
圖6 MiR-26b-5p和miR-140-3p負(fù)調(diào)控Gata4表達(dá)
7、MiR-26b-5p和miR-140-3p可消除circRNA_000203在NMV中促肥大作用
研究了miR-26b-5p、-140-3p和Gata4 siRNA對(duì)ANG - II處理的NMVCs肥大的一致影響。FITC-Phalloidin染色顯示，在經(jīng)過(guò)ANG - II處理的NMVCs中，細(xì)胞大小顯著增加，但分別轉(zhuǎn)染miR-26b-5p、-140-3p和Gata4 siRNA后，這種細(xì)胞大小增加的情況可以被逆轉(zhuǎn)(圖7A)。Ang-II-treated NMVCs中，ANP、β-MHC和GATA4的蛋白表達(dá)是顯著增強(qiáng)，但miR-26b-5p、140-3p和GATA4 siRNA轉(zhuǎn)染后其表達(dá)回降(圖7B)。FITC-Phalloidin染色結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)circRNA_000203的NMVCs細(xì)胞尺寸明顯增加，但miR-26b-5p、-140-3p和Gata4 siRNA可以降低細(xì)胞大小(圖7C)。此外，circRNA_000203-modified NMVCs細(xì)胞中ANP的蛋白表達(dá)、β-MHC和GATA4表達(dá)是顯著增加，但miR-26b-5p、-140-3p和Gata4 siRNA 轉(zhuǎn)染后其表達(dá)下調(diào)(圖7 d)。
圖7 MiR-26b-5p和miR-140-3p減輕circRNA_000203對(duì)NMV的促肥大作用
結(jié) 論：
總之，研究表明，circRNA_000203在心肌肥厚中上調(diào)，在體內(nèi)和體外均促進(jìn)心肌肥厚生長(zhǎng)。CircRNA_000203可海綿化miR-26b-5p、-140-3p，增加GATA4表達(dá)，促進(jìn)心肌肥厚（圖8）。
圖8 圖形摘要