CircTLK1通過miR-136-5p促進腎癌的增殖和轉移

    越來越多的證據表明，circRNAs是潛在的生物標志物，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關鍵調控因子。然而，circRNAs在腎癌中的確切作用尚不清楚。因此，小編在這里介紹了發(fā)表于“molecular cancer”的文章“CircTLK1 promotes the proliferation and metastasis of renal cell carcinoma by sponging miR-136-5p”。

    在本研究中，我們通過對RCC細胞株的circRNA高通量測序，將circRNA-TLK1（circTLK1）鑒定為一個新的候選基因。通過qRT-PCR檢測腎細胞癌組織和細胞中mRNA、circRNA和miRNA的表達水平。我們進行了功能缺失實驗來檢測circTLK1在體外和體內RCC細胞表型中的生物學作用。最后采用RNA-FISH、RNA下拉、雙熒光素酶報告、western blot和免疫組化等方法研究了circTLK1功能的分子機制。
結 果：
1.circTLK1在腎癌組織中高表達，其表達與預后不良顯著相關
    為了探討circRNA在腎細胞癌中的表達，我們進行RNA測序。結果發(fā)現(xiàn)正常腎上皮細胞和腎細胞癌細胞之間存在7335個circRNA的差異表達，其中上調1919條，下調5416條（圖1a）。circTLK1（hsa_circ_0004442）是所有候選基因中上調幅度最大的一個。因此，我們研究了circTLK1在腎癌細胞和正常腎上皮細胞中的表達。數(shù)據顯示，在ACHN、786-O和769-P細胞中，circTLK1的表達明顯高于在HK2和293T細胞中的表達（圖1b）。CircTLK1不僅在腎癌組織中高表達（圖1c），而且在腎癌術后轉移患者中高表達（圖1d）。此外，與低circTLK1表達相比，腎癌患者高circTLK1表達與較低的總生存率（圖1e）和較低的無病生存率（圖1f）呈負相關，提示circTLK1可能是一種預后腫瘤標志物。circTLK1來源于TLK1的第9外顯子和第10外顯子，形成247nt的循環(huán)轉錄本（圖1g）。進一步的序列分析顯示circTLK1長247nt，包含兩個外顯子。此外，我們發(fā)現(xiàn)TLK1的外顯子發(fā)生了頭到尾剪接（圖1h）。檢測circTLK1的穩(wěn)定性，結果顯示RNase R不能消化circTLK1，但經RNase R處理后TLK1的mRNA表達顯著下降（圖1i）。

2.circTLK1基因敲除抑制腎癌細胞增殖
    為了鑒定circTLK1在腎癌中的病理功能，我們合成了一種特異性靶向于circTLK1的shRNA質粒載體，發(fā)現(xiàn)該載體穩(wěn)定抑制三種腎癌細胞系中circTLK1的表達（圖2a）。在shRNAs中，shRNA-2的敲除效率最高。然而，抑制circTLK1并沒有改變TLK1的mRNA（圖2b）和蛋白質（圖2c）的表達。然后我們研究了circTLK1對腎癌細胞增殖的影響。CCK-8檢測顯示circTLK1敲除減慢了RCC細胞的生長（圖2d）。菌落形成分析表明，在circTLK1沉默后，菌落數(shù)量明顯減少（圖2e，f）。

3.circTLK1基因敲除抑制RCC細胞的遷移和侵襲
    我們進行transwell實驗，觀察circTLK1對RCC細胞遷移和侵襲的影響。我們的結果表明， circTLK1下調降低了RCC細胞的遷移能力（圖3a-c）。此外，circTLK1敲除抑制RCC細胞侵襲（圖4d）?；赾ircTLK1在腎癌細胞遷移和侵襲中的作用，我們推測circTLK1可能介導腎癌細胞的上皮-間質轉化（EMT）過程。如圖3e所示，間充質標記物N-cadherin和vimentin在circTLK1沉默的細胞中的表達顯著降低，而上皮標記物E-cadherin在circTLK1抑制細胞中的表達增加。

4.circTLK1起到miR-136-5p海綿的作用
    為了闡明circTLK1的分子機制，我們進行了FISH和核質分離分析來檢測circTL1K的亞細胞定位。如圖4a，b所示，我們發(fā)現(xiàn)circTLK1主要位于細胞質中，這表明circTLK1可能作為ceRNA來捕獲miRNAs，導致特定的靶向轉錄物的釋放。為了研究這個假設，我們利用circRNA相互作用數(shù)據庫預測circTLK1的潛在靶點，我們選擇了5種可能結合的miRNA，包括miR-136-5p、miR-421、miR-659、miR660-5p和miR-944。然后，進行RNA pull down分析評估circTLK1是否能直接捕獲這些候選miRNAs。當circTLK1過表達時，生物素化的circTLK1探針顯著降低了RCC細胞中的circTLK1（圖4c）。我們的結果顯示miR-136-5p是腎癌細胞中僅有的被生物素化circTLK1探針大量拉下的miRNA（圖4d）。此外，我們構建了野生型（WT）和突變型（Mut）circTLK1熒光素酶報告子，以檢測miR-136-5p在circTLK1活性調節(jié)中的作用。轉染后，我們觀察到miR-136-5p的過表達顯著抑制WT-circTLK1熒光素酶報告活性，但不抑制Mut-circTLK1熒光素酶報告活性（圖4e，f）。然而，circTLK1的過表達或敲除對腎癌細胞miR-136-5p的表達沒有影響（圖4g，h）。此外，miR-136-5p的過表達或敲除并不調節(jié)RCC細胞中circTLK1的表達（圖4i，j）。這些實驗都表明circTLK1作為miR-136-5p的海綿。

5.miR-136-5p通過靶向CBX4促進腎癌進展
    為了確定miR-136-5p的潛在基因，我們利用TargetScan、miRDB、Starbase和miRTarBase數(shù)據庫進行了生物信息學分析，選擇CBX4、GNAS、LUZP6、MSL2、MTMR4和SOCS7作為miR136-5p的潛在靶點（圖5a）。進一步的綜合轉錄分析表明miR-136-5p表達與CBX4表達呈負相關（圖5b）。為了研究CBX4是否可能是miR-136-5p的靶點，使用含有miR-136-5p結合序列的CBX4的3'UTR的WT或Mut序列合成熒光素酶報告質粒（圖5c）。熒光素酶報告分析結果表明，miR136-5p模擬物和CBX4-WT質粒的共轉染顯著降低了熒光素酶的活性。然而，miR-136-5p模擬物和CBX4 Mut質粒的共轉染并沒有改變熒光素酶的活性（圖5d）。此外，miR-136-5p的強制表達抑制了C B x 4的mRNA和蛋白表達（5e-g）。接下來，我們檢測了CBX4在腎癌進展中的作用。如圖5h所示，與正常組織相比，RCC組織中CBX4表達上調。我們發(fā)現(xiàn)CBX4的表達與腫瘤大小和術后轉移呈正相關（圖5i，j）。此外，腎細胞癌患者中CBX4的高表達與較低的總生存率相關（圖5k）。

6.CBX4基因敲除抑制RCC細胞增殖、遷移和侵襲
    我們研究了CBX4在腎癌細胞表型中的作用。使用shRNA靶向circTLK1，我們有效地抑制了其在ACHN和769-P細胞中的表達（圖6a）。通過CCK-8分析，我們發(fā)現(xiàn)沉默CBX4顯著抑制ACHN和769-P細胞的增殖（圖6b，c）。結腸形成實驗還表明，CBX4的敲除大大削弱了RCC細胞的增殖能力（圖6d，e）。進一步的實驗表明，沉默CBX4顯著抑制ACHN和769-P細胞的遷移和侵襲（圖6f-i）。此外，我們發(fā)現(xiàn)CBX4的mRNA水平與TCGA數(shù)據庫和我們的數(shù)據集（圖6j）中的VEGF mRNA水平正相關。CBX4基因敲除抑制VEGFA的mRNA和蛋白質水平（圖6k）。

7.CBX4過表達逆轉circTLK1抑制細胞增殖和轉移的作用
    為了探討circTLK1是否通過調節(jié)CBX4的表達而發(fā)揮其生物學功能，我們進行了挽救實驗。我們發(fā)現(xiàn)敲除circTLK1明顯抑制CBX4的mRNA和蛋白表達（圖7a，b）。CCK-8分析顯示CBX4過表達顯著逆轉了circTLK1抑制誘導的ACHN和769-P細胞生長曲線抑制（圖7c）。菌落形成分析表明，強制表達CBX4逆轉了circTLK1沉默誘導的細胞增殖抑制（圖7d，e）。此外，CBX4上調顯著逆轉了circTLK1沉默誘導的RCC細胞遷移（圖7f-i）和侵襲（圖7j，k）抑制。

8.circTLK1基因敲除抑制RCC細胞在體內的生長和轉移
    為探討circTLK1在RCC體內生長和肺轉移中的作用，將轉染shcircTLK1或shNC的穩(wěn)定769-P細胞注入裸鼠體內，建立裸鼠移植瘤和肺轉移模型。在異種移植瘤模型中，來自轉染shcircTLK1的細胞的腫瘤比來自轉染shNC的細胞的腫瘤?。▓D8a）。circTLK1基因敲除顯著抑制腫瘤體積和重量（圖8b-c）。此外，敲除circTLK1抑制CBX4和VEGFA在體內的mRNA表達（圖8d）。IHC分析表明，circTLK1的表達降低抑制了Ki67、CBX4和VEGFA的表達（圖8e）。在裸鼠肺轉移模型中，抑制circTLK1導致肺轉移顯著減少（圖8f-g）。此外，HE染色顯示shcircTLK1組的肺腫瘤灶比shNC組少（圖8h）。異種移植瘤模型顯示CBX4的過表達逆轉了circTLK1的沉默導致的細胞生長抑制（圖8i-k）。總之，circTLK1通過海綿化miR513a-5p調節(jié)CBX4的表達促進腎癌的生長和轉移（圖8l）。

結 論：
    circTLK1通過吸收miR-136-5p來增加CBX4的表達，在RCC進程中發(fā)揮關鍵作用。circTLK1可能作為RCC的診斷生物標志物和治療靶點。