TRIM24促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長和侵襲性

    膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞（GSCs）是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）細(xì)胞的一個亞群，對腫瘤的侵襲和抗腫瘤治療具有重要意義。然而，對TRIM24在GSCs中的作用和機(jī)制知之甚少。今天小編為大家?guī)戆l(fā)表于“Neuro-Oncology”的文章“TRIM24 Promotes Stemness and Invasiveness of Glioblastoma Cells via Activating SOX2 Expression”，為大家詳細(xì)介紹TRIM24在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的作用。

    在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)TRIM24與CD133和Nestin在GBM組織和腫瘤球細(xì)胞中共表達(dá)。限制性稀釋試驗和異種移植實驗表明，TRIM24表達(dá)的下調(diào)降低了GSC的自我更新能力和侵襲性生長。TRIM24表達(dá)水平與瘤周T2WI異常體積呈正相關(guān)。拯救實驗表明TRIM24參與了GBM的滲透傳播。染色質(zhì)免疫沉淀、報告基因分析、PCR、Western blot和免疫組化結(jié)果顯示TRIM24在體內(nèi)外均能激活SOX2的表達(dá)，調(diào)節(jié)GBM的干細(xì)胞和侵襲。最后，通過檢測我們研究的樣本和探索外部數(shù)據(jù)庫，驗證了TRIM24和SOX2之間的密切關(guān)系。
結(jié) 果：
1.TRIM24富集于GSCs中
    由于GSCs優(yōu)先位于血管周圍，為了評估TRIM24與GSCs之間的關(guān)系，我們用TRIM24抗體和內(nèi)皮標(biāo)志物CD31標(biāo)記GBM手術(shù)標(biāo)本。免疫熒光分析顯示血管周圍部分GBM細(xì)胞有較強(qiáng)的TRIM24染色。此外，TRIM24通常與干細(xì)胞標(biāo)記物共表達(dá)，包括CD133和Nestin（圖1A）。流式細(xì)胞術(shù)分析證實TRIM24和CD133在一部分GBM細(xì)胞中重疊表達(dá)（圖1B）。接著為了評估TRIM24表達(dá)與腫瘤球形成能力間的關(guān)系，我們在干細(xì)胞允許培養(yǎng)基中培養(yǎng)了GBM細(xì)胞。TRIM24低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞不能增殖，而TRIM24高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞至少能增殖5代（圖1C）。另外，TRIM24，CD133和Nestin在腫瘤球細(xì)胞中共表達(dá)（圖1D）。Western-blot分析顯示FACS分類的CD133+細(xì)胞與CD133-細(xì)胞相比具有高的TRIM24表達(dá)（圖1E）。此外，與GBM細(xì)胞系和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞相比，GSCs和NSCs中內(nèi)源性TRIM24水平明顯升高（圖1F）。

2.TRIM24對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長至關(guān)重要
    鑒于TRIM24在具有GSC特性的GBM細(xì)胞中富集，我們推測TRIM24可能促進(jìn)GSC的維持。限制性稀釋試驗表明，TRIM24表達(dá)的降低顯著地抑制了GSCs的腫瘤球形成能力（圖2A）。來自新鮮手術(shù)標(biāo)本的原代分離GBM細(xì)胞中TRIM24的敲除降低了CD133+亞群（圖2B）。另一方面，與對照組相比，TRIM24的過表達(dá)增加了GBM-19腫瘤球細(xì)胞的成球能力和原代分離GBM-19細(xì)胞的CD133+亞群（圖2C）。此外，TRIM24基因敲除導(dǎo)致的腫瘤球形成能力的損傷可以通過重新導(dǎo)入抗shRNA的TRIM24-WT來恢復(fù)（圖2D）。為了進(jìn)一步探討TRIM24在體內(nèi)的功能，我們將不同處理的GSCs移植到裸鼠腦中。與非靶向?qū)φ战M相比，TRIM24基因敲除抑制了腫瘤的形成，大大延長了動物存活時間（圖2E）。

3.TRIM24通過驅(qū)動SOX2表達(dá)影響GBM干性
    我們進(jìn)行了RNA測序和實時RT-PCR分析，并著重研究了GBM增殖所必需的可能調(diào)節(jié)因子。我們發(fā)現(xiàn)，TRIM24敲除后SOX2的轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)（圖3A）。雙熒光分析顯示TRIM24基因敲除顯著降低了SOX2啟動子報告子的相對熒光素酶活性（圖3B）。此外，芯片分析顯示TRIM24-WT與SOX2啟動子結(jié)合，而TRIM24突變體沒有（圖3C和D）。此外，該結(jié)合被TRIM24缺失或FBS誘導(dǎo)分化下調(diào)（圖3D）。功能分析顯示在缺失TRIM24后，體外腫瘤球形成能力和體內(nèi)腫瘤形成能力的降低可以通過再次引入SOX2來挽救（圖3E）。這些結(jié)果提示TRIM24激活SOX2表達(dá)，調(diào)節(jié)GSCs的自我更新和腫瘤形成。免疫組織化學(xué)分析表明，對照組GSCs浸潤到小鼠腦實質(zhì)和白質(zhì)束。有趣的是，TRIM24下調(diào)的腫瘤細(xì)胞形成了邊界清楚的橢圓形移植物（圖3F）。

4.TRIM24表達(dá)水平與T2加權(quán)MRI異常相關(guān)
    鑒于廣泛的侵襲性生長是GBM患者預(yù)后不良的重要因素，并且TRIM24影響異種移植的組織學(xué)特征，我們試圖將TRIM24的表達(dá)水平置于臨床背景中。結(jié)果顯示高TRIM24表達(dá)的GBM患者與低表達(dá)的患者相比，腫瘤周圍T2WI異常體積更大（圖4A和B）。TRIM24的表達(dá)與腫瘤體積之間也存在顯著相關(guān)性（圖4C）。此外，通過測量最大擴(kuò)展，也觀察到了類似的結(jié)果（圖4D和E）。

5.TRIM24通過SOX2促進(jìn)GBM的體內(nèi)外侵襲性
    TRIM24在高侵襲性GBMs中的過表達(dá)促使我們深入研究TRIM24對細(xì)胞遷移和侵襲的影響。愈合試驗表明，TRIM24基因敲除抑制了大量GBM細(xì)胞的遷移，TRIM24基因上調(diào)增強(qiáng)了GBM細(xì)胞的遷移。Transwell分析表明，TRIM24的敲除導(dǎo)致原代分離的GBM培養(yǎng)物和成熟的GBM細(xì)胞系的侵襲減少（圖5A和B）。另一方面，上調(diào)TRIM24的表達(dá)增加了GBM細(xì)胞的侵襲能力（圖5C）。接下來，我們將不同感染細(xì)胞原位移植到裸鼠體內(nèi)。在攜帶TRIM24上調(diào)細(xì)胞的小鼠中，神經(jīng)癥狀出現(xiàn)的潛伏期顯著縮短（圖6A）。異種移植切片的免疫組化分析表明，TRIM24的過表達(dá)增加了GBM細(xì)胞的滲透性傳播（圖6B）。Transwell分析顯示，通過重新引入SOX2或TRIM24-WT（圖5B），可以挽救TRIM24基因敲除后GBM細(xì)胞侵襲力的下降。同樣，在TRIM24基因敲除后，GSC腫瘤球細(xì)胞的侵襲性降低，可以通過重新導(dǎo)入SOX2或TRIM24-WT，但不通過TRIM24突變體。另一方面，在體外和體內(nèi)，SOX2沉默抑制了TRIM24上調(diào)細(xì)胞的侵襲性表型（圖5C；圖6B）。

6.TRIM24-SOX2相關(guān)性存在于臨床環(huán)境中
    為了進(jìn)一步探討TRIM24和SOX2在臨床中的關(guān)系，我們評估了它們在手術(shù)標(biāo)本中的表達(dá)水平。Western blot分析顯示TRIM24和SOX2蛋白水平之間存在顯著相關(guān)性（圖6C）。通過使用RT-qPCR分析和探索外部數(shù)據(jù)庫（圖6D和E），發(fā)現(xiàn)它們在轉(zhuǎn)錄水平上的緊密聯(lián)系也很明顯。此外，免疫熒光分析顯示TRIM24和SOX2染色在腫瘤切片中強(qiáng)烈重疊，進(jìn)一步證實了它們在GBMs中的密切相關(guān)性。

結(jié) 論：
    TRIM24在GSCs中特別富集，并調(diào)控GSC的特性。此外，臨床和實驗數(shù)據(jù)建立了TRIM24在腫瘤干細(xì)胞中激活SOX2表達(dá)的新的功能機(jī)制。這些發(fā)現(xiàn)表明，TRIM24是GBM治療的一個有吸引力的治療靶點(diǎn)。