miR-26a調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞胞外囊泡的分泌

    細(xì)胞外囊泡（EV）參與癌癥進(jìn)展過程中的細(xì)胞間通訊，因此，闡明腫瘤細(xì)胞中EV分泌的機(jī)制將有助于EV靶向腫瘤治療的發(fā)展。今天小編給大家介紹發(fā)表于“SCIENCE ADVANCES”上的文章“miR-26a regulates extracellular vesicle secretion from prostate cancer cells via targeting SHC4, PFDN4, and CHORDC1”，帶大家詳細(xì)了解EVs參與前列腺癌進(jìn)展的機(jī)制。

    在這里，我們進(jìn)行了基于miRNA的高通量篩選，使用外篩試驗(yàn)來識(shí)別EV分泌的調(diào)節(jié)因子。通過這種方法，我們鑒定了miR-26a參與前列腺癌（PCa）細(xì)胞的EV分泌。此外，我們發(fā)現(xiàn)SHC4、PFDN4和CHORDC1基因在PCa細(xì)胞中調(diào)節(jié)EV的分泌。在體內(nèi)研究中，這些基因被抑制。
結(jié) 果：
1.PCa中調(diào)控EV分泌的miRNA的篩選
    首先，我們將PC3M細(xì)胞接種于96孔板中，用miRNA模擬物進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，將培養(yǎng)基改為無血清培養(yǎng)基，再孵育48小時(shí)。之后，收集CM，評(píng)估EV水平（圖1A）。我們對(duì)傳統(tǒng)的EV標(biāo)記物進(jìn)行免疫印跡，并通過免疫印跡確認(rèn)來源于PC3M的EV為CD9和CD63陽性（圖1B）；因此，我們使用CD9抗體檢測(cè)第一次篩查中CD9/CD9雙陽性EV分泌的變化。
    接下來，我們進(jìn)行了miRNA的篩選。根據(jù)圖1C所示的標(biāo)準(zhǔn)選擇miRNAs。我們進(jìn)行了三次篩選并選擇了58個(gè)miRNAs。在排除數(shù)量大于2000的miRNAs后，我們選擇了30個(gè)miRNAs（圖1C）。接下來，為了進(jìn)一步驗(yàn)證最初的篩選，我們?cè)u(píng)估這30個(gè)miRNAs中CD63/CD63陽性EVs和CD9/CD63雙陽性EVs的分泌情況。根據(jù)EV分泌/細(xì)胞活力相對(duì)值低于0.8的標(biāo)準(zhǔn)，我們選擇miR-26a和miR-194作為調(diào)節(jié)EV分泌的候選miRNA（圖1D）。與正常前列腺組織相比， miR-26a在前列腺癌組織中顯著下調(diào)，而miR-194的表達(dá)與正常前列腺組織相比沒有差異（圖1E）。這些結(jié)果提示miR-26a參與PCa的EV分泌。此外，轉(zhuǎn)染miR-26a模擬物的PCa細(xì)胞分泌的EVs顆粒數(shù)顯著減少（圖1F，G）。因此，選擇miR-26a進(jìn)行下一步分析，并探討miR-26a是否調(diào)節(jié)PCa中EV的分泌。

2.SHC4、PFDN4和CHORDC1參與miR-26a介導(dǎo)的EV分泌
    為了進(jìn)一步闡明miR-26a在EV分泌中的分子機(jī)制，我們鑒定了miR-26a的靶基因。在miR-26a模擬物或?qū)φ瘴镛D(zhuǎn)染后，對(duì)PC3M和PC3進(jìn)行mRNA微陣列分析。發(fā)現(xiàn)PCa細(xì)胞中miR26a的過表達(dá)下調(diào)了88個(gè)基因（圖2A）。然后，為了篩選調(diào)節(jié)EV分泌的基因，利用ExoScreen進(jìn)行高通量篩選。將PC3M細(xì)胞接種于96孔板上，轉(zhuǎn)染88個(gè)候選基因的siRNA。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，將培養(yǎng)基改為無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)48小時(shí)。從轉(zhuǎn)染的PC3M細(xì)胞中，收集CM，通過ExoScreen和MTS分析評(píng)估EV水平（圖2B）。CD9-和CD63-陽性的EVs通過ExoScreen進(jìn)行評(píng)估。所選基因的標(biāo)準(zhǔn)如圖2C所示。最后，SHC4，PFDN4，CHORDC1和PRKCD被確定為調(diào)節(jié)EV分泌的候選基因（圖2C）。接著，我們探究這些基因?qū)iRNA處理后PCa細(xì)胞分泌EVs的影響。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染SHC4、PFDN4和CHORDC1三個(gè)基因的siRNAs后，PCa細(xì)胞分泌的EV水平降低，表明這些基因是EV分泌的調(diào)節(jié)因子（圖2D和E）。qRT-PCR證實(shí)了轉(zhuǎn)染siRNA的PCa細(xì)胞中這三個(gè)基因的下調(diào)（圖2F）。這些結(jié)果提示SHC4、PFDN4和CHORDC1參與了PCa中EV分泌的上調(diào)。

3.miR-26a通過靶向SHC4、PFDN4和CHORDC1抑制PCa癌細(xì)胞EV分泌
    通過qRT-PCR和免疫印跡分析，發(fā)現(xiàn)miR-26a抑制PCa細(xì)胞中SHC4、PFDN4和CHORDC1的表達(dá)水平（圖3A）。然后，為了確定miR-26a是否直接調(diào)控這些基因，進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告分析（圖3B）。發(fā)現(xiàn)miR-26a的異位表達(dá)顯著抑制野生型SHC4、PFDN4和CHORDC1 3’UTRs的熒光素酶活性（圖3C）。此外，我們還研究了這些基因在PCa組織中的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)PCa組織中PFDN4和CHORDC1的表達(dá)水平明顯高于正常組織（圖3D）。

4.PFDN4、SHC4和CHORDC1在體內(nèi)調(diào)節(jié)EV分泌和促進(jìn)腫瘤發(fā)生
    miR-26a抑制PCa的腫瘤形成，其抗腫瘤活性可能與miR-26a抑制PCa細(xì)胞分泌EV有關(guān)。為了證實(shí)miR-26a靶向基因在PCa衍生EVs中的作用，我們進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。研究發(fā)現(xiàn)，這些基因的缺失抑制了EV的分泌（圖4A）。我們?cè)u(píng)估了SHC4、PFDN4和CHORDC1下調(diào)在該模型中的作用，發(fā)現(xiàn)缺失這些基因的異種移植的小鼠腫瘤較小，重量小于對(duì)照小鼠（圖4B，C）。此外，注射PC3M來源的EVs的裸鼠腫瘤組織顯示部分挽救的腫瘤大小和重量（圖4D）。上述數(shù)據(jù)表明，miR26a與其靶基因SHC4、PFDN4和CHORDC1之間存在一個(gè)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，并證明了miR-26a在PCa中調(diào)節(jié)EV分泌的新機(jī)制（圖5）。

結(jié) 論：
    本研究廣泛篩選了PCa中調(diào)節(jié)EV分泌的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-26a通過靶向SHC4、PFDN4和CHORDC1調(diào)節(jié)EV分泌。這一發(fā)現(xiàn)揭示了miRNA通過抑制EV生物發(fā)生抑制腫瘤的新思路，為PCa的治療提供了新的途徑。