BATF2 mRNA的m6A甲基化修飾在胃癌中的功能抑制作用

    由于惡性增殖和轉移的發(fā)生，胃癌患者預后不佳。BATF2在其它腫瘤中被發(fā)現(xiàn)能夠降低腫瘤細胞的增殖和侵襲，誘導腫瘤細胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn)BATF2的mRNA水平可能與N6-甲基腺苷(m6A)甲基化修飾有關，然而BATF2在胃癌（GC）中的生物學功能及其調控機制尚不清楚。福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院的謝建偉等人于2020年7月在Molecular Cancer（IF=15.302）這一雜志發(fā)表文章，研究METTL3/BATF2/p53/ ERK在GC發(fā)展中的作用，探究BATF2在GC中的臨床意義及調控機制。
技術路線圖：

研究結果：
1.BATF2表達降低與胃癌患者預后不良相關
    對8對GC和正常胃組織進行轉錄組測序發(fā)現(xiàn)GC中871個基因表達下調，這些基因在TCGA-STAD和ACRG數據庫中的生存分析結果（P<0.01）顯示5個基因可作為GC患者的預后標志物, 其中BATF2被確認是下調基因。在組織和細胞中，通過WB、PCR和免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)在腫瘤中BATF2的表達水平降低。BATF2低表達患者的總體和無病生存率明顯低于BATF2高表達患者，并且多變量Cox回歸分析顯示，BATF2是獨立預后因素。

2. 體內、外實驗中，BATF2抑制腫瘤的生長
    集落形成實驗顯示，BATF2表達上調（過表達）抑制腫瘤細胞增殖，BATF2表達下調（敲除）則相反。流式細胞術檢測結果顯示BATF2表達增加，G1期細胞增多，細胞的生長受到抑制，而敲除BATF2導致G1期細胞減少。移植瘤實驗顯示BATF2高表達的小鼠中腫瘤的生長速度比較慢，BATF2低表達的小鼠則較快。免疫組化結果顯示，BATF2高表達組中Ki-67（增殖細胞的標記）評分低于BATF2低表達組中。這些結果提示BATF2可能通過調節(jié)細胞周期來抑制GC。

3. 在體內、外實驗中，BATF2調節(jié)GC轉移
    細胞實驗中，BATF2過表達顯著抑制GC細胞的遷移和侵襲，BATF2敲除則增加遷移和侵襲。移植瘤實驗的生物發(fā)光成像結果顯示，注射過表達BATF2細胞的小鼠胃癌肺轉移明顯減少。轉移菌落數量、轉移性結節(jié)和腹膜轉移實驗結果顯示，BATF2在抑制胃癌轉移中發(fā)揮重要作用。

4. BATF2調節(jié)ERK信號抑制GC
    基因探針富集分析(GSEA)顯示，BATF2與MAPK信號通路相關。人磷酸激酶芯片檢測BATF2的信號轉導影響，結果顯示BATF2過表達降低了ERK的磷酸化，BATF2敲除增強了ERK的磷酸化。WB和免疫組化結果驗證上述實驗?；赥MA的免疫組化驗證了低BATF2表達組中62.6%的患者p-ERK水平增強。
    在BATF2敲除的GC細胞中抑制p-ERK（U0126， ERK抑制劑）能逆轉細胞的增殖、侵襲和遷移。而且，文章中分析了在BATF2過表達或敲除的細胞中ERK介導的轉錄靶基因MMP2, MMP9,和cyclin D1的表達變化。
    隊列研究表明BATF2調節(jié)ERK磷酸化可能是BATF2在GC中抑制腫瘤功能的機制。

5. 在p53存在的情況下，BATF2控制ERK磷酸化
    互作基因(STRING)數據庫中發(fā)現(xiàn)p53蛋白可能與BATF2相互作用，并且過表達BATF2會導致p53蛋白表達增加，而沉默BATF2會降低p53的表達。移植瘤免疫組化顯示p53蛋白與BATF2表達呈正相關，細胞免疫熒光顯示p53蛋白與BATF2共定位，co-IP檢測顯示BATF2和p53蛋白相互作用，但是qRT-PCR檢測顯示BATF2和p53表達沒有顯著相關性，因此文章中推測BATF2可能通過翻譯后修飾調控p53蛋白水平。
    加入翻譯抑制劑cycloheximide(CHX)后，BATF2過表達顯著增加了p53蛋白的半衰期。MG132，一種蛋白酶體抑制劑，挽救了BATF2過表達誘導的p53蛋白水平變化。沉默p53可以恢復GC細胞的增殖和轉移能力。沉默p53表達可顯著消除BATF2對p-ERK、MMP2、MMP9和cyclin D1水平的抑制作用(圖5k)。綜上所述，這些結果表明BATF2的缺失促進了泛素介導的p53降解，從而激活了ERK信號。

6. GC中，METTL3介導BATF2 mRNA的m6A修飾
    沉默METTL3的表達能增加BATF2的表達，反之亦然。我們發(fā)現(xiàn)，在GC細胞中，BATF2 mRNA m6A修飾與METTL3表達呈正相關?；赥MA的免疫組織分析顯示，METTL3在GC中的表達與BATF2存在一定程度的負相關。熒光素酶報告基因檢測確定BATF2的3個未翻譯區(qū)域(3’UTR)特異性m6A修飾位點-MUT3位點。這些結果表明，在GC中，m6A通過METTL3維持了BATF2 mRNA的穩(wěn)定性。

總 結：
1.文章揭示了BATF2在胃癌發(fā)展中的抑癌作用。
2.BATF2表達顯著下調與胃癌患者預后不良相關。
3.METTL3/BATF2/p53/ERK通過調節(jié)細胞周期和ECM降解抑制GC生長和轉移。綜上，BATF2可能是潛在的胃癌預測因子和治療靶點