一種可能導(dǎo)致肝癌抗PD1治療耐藥性的新機(jī)制

        自然殺傷（NK）細(xì)胞在先天性抗腫瘤免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。最近，已經(jīng)在包括肝細(xì)胞癌（HCC）在內(nèi)的各種惡性腫瘤中證實(shí)了NK細(xì)胞功能障礙。然而，人類(lèi)肝癌中NK細(xì)胞功能障礙的分子生物學(xué)機(jī)制仍然不清楚。6月27日，來(lái)自復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院肝癌研究所的張鵬飛團(tuán)隊(duì)在molecular cancer（IF=15.302）上發(fā)表論文。他們報(bào)道在人類(lèi)HCC組織中circUHRF1的表達(dá)高于在匹配的相鄰非腫瘤組織中的表達(dá)。 circUHRF1水平升高表明HCC患者的臨床預(yù)后較差，NK細(xì)胞功能異常。在HCC患者血漿中，circUHRF1主要通過(guò)外泌體方式由HCC細(xì)胞分泌，而circUHRF1抑制NK細(xì)胞衍生的IFN-γ和TNF-α的分泌。血漿外泌體circUHRF1的高水平與NK細(xì)胞比例減少和NK細(xì)胞腫瘤浸潤(rùn)減少有關(guān)。此外，circUHRF1通過(guò)miR-449c-5p的降解上調(diào)TIM-3的表達(dá)來(lái)抑制NK細(xì)胞的功能。最后，他們表明circUHRF1可能會(huì)導(dǎo)致HCC患者抗PD1免疫療法產(chǎn)生抗藥性。以上結(jié)果為HCC患者提供潛在的治療策略。
技術(shù)路線：

結(jié) 果：
1.肝癌組織中與UHRF1相關(guān)的circRNA的分析
        UHRF1經(jīng)常被上調(diào)，并且在HCC的進(jìn)展中起著關(guān)鍵的病理作用。因此，通過(guò)qRT-PCR檢查了從UHRF1衍生的14個(gè)circRNA的水平。其中，hsa_circ_0048677（circUHRF1）是最豐富的circRNA，在HCC組織中被上調(diào)（圖1a和b）。然后，通過(guò)qRT-PCR檢查了circUHRF1在240例HCC組織和匹配的鄰近非腫瘤組織中的表達(dá)。 HCC組織中CircUHRF1的表達(dá)明顯高于相鄰的非腫瘤組織（腫瘤/相鄰的非腫瘤組織≥2； 136/240）（圖1c和d）。接下來(lái)探究circUHRF1表達(dá)與240例HCC患者的臨床病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果表明，circUHRF1表達(dá)與臨床病理特征顯著相關(guān)（圖1e-g）。Kaplan-Meier生存分析表明，circUHRF1高表達(dá)水平的患者的臨床預(yù)后較差（圖1h和i）。綜上所述，HCC細(xì)胞中circUHRF1表達(dá)上調(diào)與患者不良預(yù)后相關(guān)，并表明circUHRF1表達(dá)增加可能與HCC的進(jìn)展有關(guān)。

2.HCC細(xì)胞以外泌體方式分泌circUHRF1
        假設(shè)circUHRF1可以通過(guò)外泌體從HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移到其他細(xì)胞。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，從HCC細(xì)胞系上清液中分離了外泌體，并通過(guò)TEM和Western印跡進(jìn)行了評(píng)估（圖2a和b）。在六個(gè)HCC細(xì)胞系和成對(duì)的外泌體中進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果與其他細(xì)胞系相比，HCCLM3和SMMC-7721細(xì)胞系中circUHRF1明顯上調(diào)，外泌體表達(dá)結(jié)果與親代細(xì)胞的表達(dá)水平一致（圖2c和2d）。與20名健康捐獻(xiàn)者相比，HCC患者血漿外泌體circUHRF1水平升高（圖2e）。此外，腫瘤切除后血漿外泌體circUHRF1水平降低，而在腫瘤復(fù)發(fā)患者中血漿外泌體circUHRF1水平升高，表明血漿外泌體circUHRF1主要由HCC細(xì)胞產(chǎn)生（圖2e）。有免疫逃逸的患者血漿中外泌體circUHRF1水平顯著升高，外周血中NK細(xì)胞比例降低（圖2f）。這些數(shù)據(jù)表明血漿外泌體circUHRF1可以作為NK細(xì)胞相關(guān)的免疫逃逸的關(guān)鍵分子。

3.HCC細(xì)胞通過(guò)外泌體circUHRF1抑制NK細(xì)胞功能
        為了確定HCC衍生的外泌體circUHRF1是否能誘導(dǎo)異體NK細(xì)胞發(fā)生改變，將來(lái)自6個(gè)健康供體的NK細(xì)胞與HCCLM3和SMMC-7721細(xì)胞以1：1的比例共培養(yǎng)24小時(shí)（圖3a）。與SMMC-7721和HCCLM3細(xì)胞共培養(yǎng)的NK細(xì)胞表現(xiàn)出IFN-γ和TNF-α分泌的顯著損害，circUHRF1表達(dá)顯著增加（圖3a-d），這被外泌體抑制劑GW4869削弱（圖3e）。NK細(xì)胞與SMMC-7721和HCCLM3細(xì)胞先共培養(yǎng)，再用外泌體抑制劑處理，IFN-γ和TNF-α的分泌減弱（圖3f和g）。為了進(jìn)一步研究是否以外泌體circUHRF1依賴(lài)性方式介導(dǎo)HCC細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞功能的抑制作用，使用SMMC-7721和shRNA慢病毒載體建立了circUHRF1表達(dá)下調(diào)細(xì)胞。結(jié)果表明，外泌體circUHRF1水平的降低可有效減弱NK細(xì)胞中HCC衍生的外體誘導(dǎo)的IFN-γ和TNF-α分泌的損傷（圖3h-j）。這些結(jié)果共同表明，源自HCC的外泌體circUHRF1能損害NK細(xì)胞的功能。

4.CircUHRF1和miR-449c-5p在NK細(xì)胞中彼此降解
        通過(guò)StarBase v3.0分析，預(yù)測(cè)有14個(gè)miRNAs可能是circUHRF1的靶標(biāo)。使用circUHRF1特異性探針進(jìn)行circRNA體內(nèi)沉淀（circRIP），并使用qRT-PCR檢測(cè)了與circUHRF1形成復(fù)合體的14種預(yù)測(cè)miRNA。結(jié)果表明，與陰性對(duì)照相比，circUHRF1和miR-449c-5p顯著富集（圖4a），表明miR-449c-5p是與circUHRF1相互作用的miRNA。接下來(lái)進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證這一結(jié)果（圖4b-e）。此外，在NK-92細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-449c-5p后circUHRF1的水平顯著降低，而在circUHRF1過(guò)表達(dá)后miR-449c-5p的水平顯著降低（圖4f和g）。這些發(fā)現(xiàn)表明，circUHRF1和miR-449c-5p可能相互靶向，在NK細(xì)胞中相互影響。

5.CircUHRF1通過(guò)抑制miR-449c-5p活性上調(diào)TIM-3表達(dá)
        推測(cè)circUHRF1可能充當(dāng)miR-449c-5p海綿通過(guò)上調(diào)miR-449c-5p靶標(biāo)的表達(dá)水平增強(qiáng)HCC患者的免疫逃逸。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，首先分析了包括TIM-3在內(nèi)的NK細(xì)胞中一組預(yù)測(cè)的miR-449c-5p靶基因（圖5a）。接下來(lái)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證TIM-3是miR-449c-5p的靶基因（圖5b-d）。鑒于TIM-3相關(guān)途徑在免疫逃逸中的關(guān)鍵作用，假設(shè)circUHRF1可能通過(guò)其競(jìng)爭(zhēng)性circRNA活性成為HCC免疫逃逸的重要助力者。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一假設(shè)，在單獨(dú)或與circUHRF1一起轉(zhuǎn)染miR-449c-5p模擬物的NK-92細(xì)胞中檢測(cè)到TIM-3表達(dá)。結(jié)果表明， miR-449c-5p強(qiáng)迫表達(dá)導(dǎo)致TIM-3的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，而circUHRF1逆轉(zhuǎn)了miR-449c-5p對(duì)TIM-3表達(dá)的這種抑制作用（圖5b和c）。為了進(jìn)一步證實(shí)體外研究結(jié)果，調(diào)查了另一40例HCC患者中circUHRF1和miR-449c-5p / TIM-3表達(dá)之間的相關(guān)性外周NK細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)circUHRF1表達(dá)與外周NK細(xì)胞中的miR-449c-5p表達(dá)負(fù)相關(guān)，circUHRF1表達(dá)與周?chē)鶱K細(xì)胞中TIM-3 mRNA表達(dá)正相關(guān)，miR-449c-5p表達(dá)與外周NK細(xì)胞中TIM-3 mRNA的表達(dá)負(fù)相關(guān)（圖5e-g），表明外泌體circUHRF1的上調(diào)消除了miR-449c-5p對(duì)NK細(xì)胞中TIM-3的抑制作用。

6.CircUHRF1以NK細(xì)胞依賴(lài)性方式誘導(dǎo)HCC進(jìn)展
        為了進(jìn)一步探索circUHRF1在肝癌中的功能，使用了pLO5-ciR-circUHRF1慢病毒載體來(lái)上調(diào)circUHRF1在PLC / PRF / 5細(xì)胞中的表達(dá)。 qRT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pLO5-ciRcircUHRF1的PLC / PRF / 5細(xì)胞的circUHRF1水平顯著高于轉(zhuǎn)染pLO5-ciR-Mock的細(xì)胞中的circUHRF1并且外泌體更高的circUHRF1水平（圖6a和6b）。使用PLC / PRF / 5細(xì)胞生成了NOD / SCID小鼠肺腫瘤轉(zhuǎn)移模型。結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)染pLO5-ciR-Mock的HCC細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pLO5-ciR-circUHRF1的PLC / PRF / 5細(xì)胞顯示出circUHRF1水平升高，誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)移性腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目明顯增加，NKG2D陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少（圖6c-e）。這些結(jié)果表明circUHRF1以外泌體和NK細(xì)胞依賴(lài)性方式促進(jìn)HCC進(jìn)展。

7.CircUHRF1增強(qiáng)了肝癌抗pd1治療的耐藥性
        由于強(qiáng)制circUHRF1表達(dá)抑制了HCC中的NK細(xì)胞功能，因此評(píng)估了circUHRF1過(guò)表達(dá)是否可以進(jìn)一步阻止抗PD1治療（Opdivo）的抗腫瘤作用。分析了30例接受抗PD1免疫治療的復(fù)發(fā)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（包括肺轉(zhuǎn)移）的HCC患者的回顧性數(shù)據(jù)。根據(jù)RECIST1.1分析，結(jié)果顯示，部分緩解（PR）3例，疾病穩(wěn)定（SD）7例，進(jìn)行性疾?。≒D）20例，PD組的circUHRF1表達(dá)水平遠(yuǎn)高于SD和PR組（圖7a）。為了進(jìn)一步探討circUHRF1與免疫逃避之間的關(guān)系，檢查了30例HCC患者組織中NKG2D的表達(dá)。與對(duì)PD1敏感的HCC患者相比，對(duì)PD1耐藥的HCC患者的NKG2D陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少（圖7b）。分析顯示，HCC組織中circUHRF1表達(dá)與NKG2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)之間呈負(fù)相關(guān)（R2 = 0.1452； P = 0.0377）（圖7c）。為了進(jìn)一步評(píng)估circUHRF1對(duì)抗PD1治療的抗性，通過(guò)皮下植入circUHRF1基因下調(diào)的HCCLM3細(xì)胞或相應(yīng)的陰性對(duì)照細(xì)胞建立了異種移植模型。結(jié)果表明，植入circUHRF1基因敲低的細(xì)胞可提高對(duì)抗PD1治療的敏感性，并提高總生存率（圖7d-f）。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明circUHRF1過(guò)表達(dá)可能會(huì)阻礙HCC對(duì)抗PD1治療的反應(yīng)，而靶向circUHRF1可能是恢復(fù)HCC對(duì)抗PD1治療敏感性的有前途和有效的方法。

參考文獻(xiàn)：
        Zhang Peng-Fei., Gao Chao., Huang Xiao-Yong., Lu Jia-Cheng., Guo Xiao-Jun., Shi Guo-Ming., Cai Jia-Bin., Ke Ai-Wu.(2020). Cancer cell-derived exosomal circUHRF1 induces natural killer cell exhaustion and may cause resistance to anti-PD1 therapy in hepatocellular carcinoma. Mol. Cancer, 19(1), 110. doi:10.1186/s12943-020-01222-5