實錘！tRNA衍生的小RNA調(diào)節(jié)人和小鼠翻譯起始后的核糖體蛋白水平
tRNA衍生的小RNA(TsRNAs)參與了許多細(xì)胞過程，但具體機(jī)制尚不清楚。以前發(fā)現(xiàn)Leu-CAG tRNA衍生的小RNA的3’端(LeuCAG3‘tsRNA)通過維持核糖體蛋白S28(RPS28)的水平來調(diào)節(jié)人類核糖體的生物發(fā)生。本文通過實驗進(jìn)一步驗證了LeuCAG3的tsRNA可能通過一種保守的基因調(diào)控機(jī)制在脊椎動物中維持核糖體的生物發(fā)生，并于2019年12月發(fā)表在Cell Reports（IF：7.815）。
本文亮點：
1、在脊椎動物中LeuCAG3‘tsRNA的目標(biāo)靶點位于保守的RPS28編碼區(qū)；
2、LeuCAG3‘tsRNA在人和小鼠中均可調(diào)節(jié)RPS28起始階段翻譯；
3、LeuCAG3‘tsRNA調(diào)控的翻譯在人和小鼠間保守
4、tsRNA調(diào)控的翻譯機(jī)制可能在脊椎動物中保守
主要結(jié)果：
1、脊椎動物中RPS28 mRNA上的靶位點區(qū)域保守
作者先從44個脊椎動物的基因組tRNA數(shù)據(jù)庫中篩選得到22nt的LeuCAG3‘tsRNA。通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)LeuCAG3‘tsRNA在RPS28 mRNA上的靶位點具有保守性（圖1A），還發(fā)現(xiàn)兩個潛在靶點，一個在CDS區(qū)，一個在3‘UTR（圖1B和C）。靶點A和靶點B的堿基組成和結(jié)構(gòu)如圖D和E所示。
圖1位于RPS28的CDS區(qū)的LeuCAG3‘tsRNA目標(biāo)靶點在哺乳動物和鳥類中保守進(jìn)化，且小鼠的Rps28 mRNA具有雙鏈二級結(jié)構(gòu)
2、在小鼠中LeuCAG3‘tsRNA對于18S rRNA的功能是必須的
前人的研究顯示，在人類細(xì)胞中降低RPS28蛋白可通過抑制LeuCAG3‘tsRNA從而損害18S rRNA的處理途徑，同時可降低人類癌細(xì)胞的生活力。于此結(jié)果類似，在小鼠中抑制LeuCAG3‘tsRNA可顯著降低Hepa 1-6細(xì)胞的生活力（圖2A）。此外，實驗結(jié)果顯示抑制LeuCAG3‘tsRNA顯著降低了18S rRNA的水平，但并沒有顯著影響28S rRNA的豐度，并且LeuCAG3‘tsRNA不影響18S rRNA的翻譯而是處理34S媒介RNA的必須物質(zhì)（圖2B-D）。
圖2 在小鼠細(xì)胞中LeuCAG3‘tsRNA對于18S rRNA的功能是必須的
3、LeuCAG3‘tsRNA調(diào)控小鼠Rps28 mRNA翻譯
抑制LeuCAG3‘tsRNA后使用WB和qPCR檢測了Rps28 的蛋白和mRNA水平，結(jié)果顯示Rps28 的蛋白水平顯著下降而mRNA水平不變，證明LeuCAG3‘tsRNA影響翻譯（圖3A-C）。之后作者對Rps28 mRNA進(jìn)行分級，并對較重Rps28 mRNA向較輕Rps28 mRNA轉(zhuǎn)化的部分進(jìn)行了計算量化，如圖3D所示，與對照相比，抑制LeuCAG3‘tsRNA后，向較輕Rps28 mRNA轉(zhuǎn)化的數(shù)量明顯增多。以上結(jié)果證實LeuCAG3‘tsRNA調(diào)控小鼠和人的Rps28 mRNA翻譯。
進(jìn)一步探究LeuCAG3‘tsRNA的作用靶點是A還是B，進(jìn)行了WB實驗。如圖3E-F所示，與野生型相比，抑制靶點A時Rps28 蛋白水平顯著升高，而抑制靶點B后Rps28 蛋白的水平無顯著變化，表明靶點B在細(xì)胞中并不活躍。
總之，以上結(jié)果表明小鼠LeuCAG3‘tsRNA調(diào)控Rps28 蛋白翻譯主要依賴于CDS區(qū)域的保守靶點A而非靶點B。
圖3在小鼠中LeuCAG3‘tsRNA通過堿基互補(bǔ)與CDS靶位點配對對于Rps28 mRNA的翻譯是必須的
4、LeuCAG3‘tsRNA在人和小鼠中調(diào)控Rps28 mRNA翻譯后的起始階段
作者模擬了使用哈林通堿或NaAsO2受LeuCAG3‘tsRNA影響翻譯的示意圖（圖4A）。如果tsRNA影響80S復(fù)合物的形成，則哈林通堿或NaAsO2處理會使RPS28 mRNA停滯在40S亞基附近；如果tsRNA影響80S復(fù)合物形成后的步驟，則哈林通堿或NaAsO2處理會使RPS28 mRNA停滯在80S復(fù)合物上。
實驗結(jié)果如圖4B所示，與預(yù)期一致，哈林通堿或NaAsO2處理后RPS28 mRNA通常在9和14位點發(fā)生遷移，并累積在80S單核糖體上。此外，哈林通堿或NaAsO2處理后的細(xì)胞中抑制LeuCAG3‘tsRNA并不影響RPS28 mRNA在80S單核復(fù)合體上的積累。以上結(jié)果表明LeuCAG30tsRNA在人和小鼠中的翻譯后起始水平上調(diào)節(jié)RPS28 mRNA。
圖4 在人和小鼠中LeuCAG3‘tsRNA調(diào)控RPS28延伸階段的翻譯
本文報道了在靈長類動物中存在功能性的3‘UTR靶位點，而在許多脊椎動物中存在CDS靶位點。作者證實，這個tsRNA也通過與CDS目標(biāo)位點相互作用來調(diào)節(jié)小鼠Rps28的翻譯。進(jìn)一步證實，mRNA翻譯的變化發(fā)生在兩個物種的啟動后步驟?？傮w而言，結(jié)果表明LeuCAG3的tsRNA可能通過一種保守的基因調(diào)控機(jī)制在脊椎動物中維持核糖體的生物發(fā)生。
參考文獻(xiàn)：
Kim Hak Kyun., Xu Jianpeng., Chu Kirk., Park Hyesuk., Jang Hagoon., Li Pan., Valdmanis Paul N., Zhang Qiangfeng Cliff., Kay Mark A. (2019). A tRNA-Derived Small RNA Regulates Ribosomal Protein S28 Protein Levels after Translation Initiation in Humans and Mice. Cell Rep, 29(12), 3816-3824.e4. doi: 10.1016/j.celrep.2019.11.062。