microRNA的一種非典型分子機(jī)制——維持血管完整性

    MicroRNAs (miRNAs)是多種基因表達(dá)的調(diào)控因子，對(duì)包括動(dòng)脈粥樣硬化在內(nèi)的人類疾病有著深遠(yuǎn)的影響，但它們是否能夠發(fā)揮翻譯后功能來控制細(xì)胞適應(yīng)，以及這些非典型特征是否具有病理生理相關(guān)性尚不清楚。近期，來自慕尼黑大學(xué)心血管預(yù)防研究所的Donato Santovito團(tuán)隊(duì)發(fā)表在Science Translational Medicin上的研究證明miR- 126-5p在高剪切應(yīng)力和自噬環(huán)境下維持內(nèi)皮完整性。在自噬小泡表面，miR-126-5p結(jié)合argonaute-2 (Ago2)后與Mex3a形成復(fù)合物，被引導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核。在細(xì)胞核中，miR-126-5p與Ago2分離，并通過其種子序列與caspase-3結(jié)合，阻止caspase二聚并抑制其活性，從而限制細(xì)胞凋亡。

技術(shù)路線：

研究結(jié)果：
1.高剪切應(yīng)力（HSS）和自噬促進(jìn)細(xì)胞核miR-126-5p的富集
    在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）中過表達(dá)KLF2（KLF2在動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中協(xié)調(diào)大部分由剪切應(yīng)力誘發(fā)的轉(zhuǎn)錄程序），顯示出pre-miR-126和miR-126-5p表達(dá)量增加（圖1A）。在具有EC特異性Klf2缺失的Cdh5CreKlf2fl / fl小鼠的主動(dòng)脈內(nèi)膜中檢測到了較低的miR-126-5p（圖1B）。 KLF2過表達(dá)和HSS（12 dyne/cm2）增加自噬相關(guān)基因（ATG）的轉(zhuǎn)錄并促進(jìn)自噬通量，通過蛋白質(zhì)而不是轉(zhuǎn)錄本水平如微管相關(guān)蛋白LC3-I轉(zhuǎn)化為自噬體相關(guān)蛋白LC3-II和自噬底物p62的減少來實(shí)現(xiàn)（圖1C和D）。雷帕霉素對(duì)miR-126-5p具有顯著的核定位作用（圖1F-H）。qPCR證實(shí)了雷帕霉素誘導(dǎo)的內(nèi)源性miR-126-5p的核富集（圖1I）。使ATG5和ATG7沉默或使用a/b 輸入蛋白抑制劑伊維菌素可防止miR-126-5p核積累（圖1J）。用3-甲基腺嘌呤限制自噬降低了KLF2驅(qū)動(dòng)的核miR-126-5p的積累（圖1K）?？傊蒏LF2或mTOR抑制觸發(fā)的自噬控制著miR-126鏈的運(yùn)輸，并通過核轉(zhuǎn)移保留了miR-126-5p。

2.miR-126-5p的核轉(zhuǎn)移需要RNA結(jié)合蛋白Mex3a
    雷帕霉素引起AGO2和LC3的核積累，這被伊維菌素阻斷（圖3A）。 RNA免疫沉淀（IP）證實(shí)了miR-126-5p與核AGO2的優(yōu)先結(jié)合（圖3B）。在納米水平上，在雷帕霉素處理的EC中，在外表面而不是在LC3標(biāo)界的囊腔中可檢測到AGO2（圖3C）。用胰蛋白酶孵育分離的自噬體可劑量依賴性地降低AGO2的量，但不會(huì)降低LC3-II的量，因此進(jìn)一步支持了AGO2在膜外表面的定位?？傊覀兊臄?shù)據(jù)支持這樣的概念，即在自噬體表面上AGO2：miR-126-5p復(fù)合物會(huì)促進(jìn)核易位。進(jìn)行了AGO2-IP識(shí)別相互作用的蛋白質(zhì)。盡管兩者相鄰，在雷帕霉素處理過的細(xì)胞的AGO2免疫沉淀物中未檢測到LC3，核AGO2導(dǎo)航因子TNRC6A和importin-8也未檢測到（圖3D），因此排除他們的參與。Co-IP揭示了細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中AGO2和Mex3a的相互作用，這通過自噬EC的共聚焦顯微鏡得到了證實(shí)（圖3D和E）。使用受激發(fā)射損耗（STED）納米顯微鏡來觀察該復(fù)合物，證實(shí)了AGO2和Mex3a的共定位信號(hào)，而LC3信號(hào)僅顯示鄰近性（圖3F）。

3.Mex3a優(yōu)先與miR-126-5p結(jié)合
    接下來，證明了Mex3a的RNA結(jié)合，這是由兩個(gè)K同源（KH）域賦予的。核磁共振（NMR）滴定表明異質(zhì)串聯(lián)KH結(jié)構(gòu)域與miR-126-5p結(jié)合，符合亞微摩爾親和力（圖4A）。表面等離子體共振（SPR）證實(shí)全長Mex3a與固定的miR-126-5p具有高親和力結(jié)合（圖4B）。為了驗(yàn)證兩個(gè)KH域如何發(fā)生miR-126-5p結(jié)合的結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)，進(jìn)行了小角度X射線散射（SAXS），以顯示自由的KH1和KH2串聯(lián)域是靈活連接的，類似于線上的珍珠，然而，當(dāng)它們與miR-126-5p結(jié)合時(shí)，它們形成了緊湊的結(jié)構(gòu)（圖4C）。使用計(jì)算機(jī)模型估計(jì)的結(jié)合自由能（BFE）表明5p鏈比3p鏈優(yōu)先結(jié)合（圖4D），這與NMR滴定的光譜變化減少一致。通過固定的Mex3a上的SPR，等溫滴定量熱法（ITC）和暴露于核裂解液后miR-126鏈的pulldown實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-126-5p的優(yōu)先結(jié)合（圖4D）。同樣雷帕霉素處理的內(nèi)皮細(xì)胞中核Mex3a的RNA-IP揭示了miR-126-5p的優(yōu)先富集（圖4E）。 SPR顯示AGO2：Mex3a相互作用僅在存在miR-126-5p時(shí)發(fā)生，在固定化或溶液中都表明復(fù)合物中三元相互作用的特異結(jié)合（圖4F和G）。沉默Mex3a消除了雷帕霉素誘導(dǎo)的AGO2和LC3積累（圖4H）和EC細(xì)胞核中miR-126-5p的富集（圖4I）?？傊?，確定了miR-126-5p：AGO2復(fù)合物的核穿梭作用是由Mex3a依賴性過程介導(dǎo)的。

4.核miR-126-5p具有抗凋亡特性
    通過研究短期接觸雷帕霉素后miR-126-5p的基因表達(dá)變化以及miR-126-5p的功能得失來研究核miR-126-5p轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)。涉及EC生物學(xué)的多個(gè)轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)發(fā)生了變化，分析了雷帕霉素和miR-126-5p模擬物進(jìn)行一致調(diào)節(jié)的那些功能注釋（圖5A）。對(duì)KEGG途徑富集的分析揭示了對(duì)凋亡相關(guān)途徑轉(zhuǎn)錄譜的主要影響（圖5B），所以在蛋白質(zhì)水平上研究了凋亡介體。 miR-126-5p的過表達(dá)僅略微減弱了caspase-3 / 9的表達(dá)，但顯著降低了caspase-3的活性形式及其底物的裂解，這一作用需要雷帕霉素的存在來誘導(dǎo)miR-126-5p的核轉(zhuǎn)移，并且在miR-126-5p抑制后未觀察到（圖5C）。通過Mex3a下調(diào)阻止miR-126-5p的核富集會(huì)增加caspase-3的裂解物（圖5D）。通過使miR-126-5p或Mex3a沉默可以防止雷帕霉素處理后EC細(xì)胞凋亡的減少（圖5E和F）。同樣，miR-126-5p沉默會(huì)削弱Mex3a過表達(dá)介導(dǎo)的抗凋亡作用（圖5G）。

5.與caspase-3的直接相互作用傳達(dá)了miR-126-5p的抗凋亡作用
    抗凋亡作用在雷帕霉素處理后迅速發(fā)生，并且在相關(guān)介體中發(fā)生轉(zhuǎn)錄變化，從而推測了miR-126-5p具有抗凋亡特性。因此，測試了與miR-126-5p復(fù)合物的潛在相互作用。通過共聚焦顯微鏡獲得的FISH顯示了miR-126-5p和caspase-3的共定位信號(hào)，特別是在核和核周區(qū)域，并且通過Mex3a下調(diào)降低了這種共定位（圖6A-C）。在雷帕霉素處理或HSS條件下RNA-IP顯示出與核caspase-3相關(guān)的miR-126-5p顯著富集（圖6D）。使用雷帕霉素處理的EC核提取物中miR-126-5p的pulldown檢測到caspase-3和Mex3a（圖6E）。caspase-3與熒光標(biāo)記的合成miR-126-5p的共定位可通過部分或完全破壞種子序列（Mut1和Mut2）或更廣泛的突變（Mut3）來降低（圖6F）。加入miR-126-5p后caspase-3甲基信號(hào)的實(shí)質(zhì)光譜變化以及加入caspase-3后的RNA信號(hào)均表現(xiàn)出兩者直接結(jié)合（圖6G）。為了驗(yàn)證miR-126-5p可以與AGO2解離而與caspase-3結(jié)合，對(duì)固定的miR-126-5p進(jìn)行了競爭分析，結(jié)果表明caspase-3取代了AGO2與miR-126-5p的結(jié)合（圖6H）。SPR揭示了miR-126-5p劑量依賴性地破壞了caspase-3p17亞基的二聚化（圖6I）。在無細(xì)胞試驗(yàn)中，miR-126-5p劑量依賴性地減少重組caspase-3的裂解物，其最大抑制濃度（IC50）與VAD或DEVD的抑制作用相當(dāng)（圖6J），支持miR-126-5p干擾結(jié)合口袋和異二聚體的活性位點(diǎn)形成的觀點(diǎn)。種子序列突變的miR-126-5p（從Mut1到Mut3），miR-126-3p，let-7a-5p，miR-17-5p和miR-21-5p的計(jì)量改變對(duì)caspase-3無效（圖6J）?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明，在Mex3a引導(dǎo)下的核miR-126-5p與AGO2分離后，可以通過直接抑制caspase-3保護(hù)EC不受凋亡的影響。

6.miR-126-5p:Mex3a通路在體內(nèi)和人類疾病中起作用
    為了研究自噬驅(qū)動(dòng)途徑與血管疾病相關(guān)的體內(nèi)證據(jù)，通過三維（3D）反褶積免疫熒光分析了易患動(dòng)脈粥樣硬化的Apoe-/-小鼠主動(dòng)脈中LC3內(nèi)皮細(xì)胞染色模式。 LC3染色在暴露于HSS的區(qū)域比LSS的情況更為普遍（圖7A和B）。由于脂蛋白會(huì)在體外觸發(fā)EC的自噬，因此分析了高脂飲食（HFD）的作用。HFD持續(xù)12周即可顯著增加內(nèi)皮LC3染色（圖7A和B）。此外，在LSS區(qū)域，相比于在HSS區(qū)域中，LC3的核定位并不普遍并且核Ago2 + EC的百分比則較低（圖7C-E）。非病變的人頸動(dòng)脈分叉上游(暴露于HSS)的內(nèi)皮細(xì)胞比分叉下游的動(dòng)脈粥樣硬化區(qū)表現(xiàn)出更明顯的核AGO2定位（圖7F和G）。此外，共聚焦反褶積顯微鏡揭示了EC核中Mex3a和miR-126-5p的緊密定位信號(hào)（圖7H）。發(fā)現(xiàn)在未患病血管區(qū)域的EC中，Mex3a和miR-126-5p之間的相互作用距離比覆蓋動(dòng)脈粥樣硬化病變的EC中的距離低，因此反映了更高的相互作用可能性（圖7I和J）。
    使用了內(nèi)皮自噬缺陷的Apoe-/-Cdh5Cre + Atg5fl / fl（ATG5EC-KO）小鼠進(jìn)行研究。 HFD 12周后，ATG5EC-KO小鼠的LSS和HSS區(qū)域胸主動(dòng)脈中帶有核Ago2和miR-126-5p信號(hào)的EC的百分比和核miR-126-5p含量均低于對(duì)照組（圖7K-M）。循環(huán)中CD31 +膜聯(lián)蛋白V + ABs和miR-126-3p濃度增加表明ATG5EC-KO小鼠EC凋亡增加（圖7N）。由于凋亡破壞了內(nèi)皮的完整性以促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，HFD持續(xù)12周后，ATG5EC-KO小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化負(fù)擔(dān)相應(yīng)增加（圖7O），這是由于HSS區(qū)域顯著加重所致（圖7P）。與ATG5EC-KO小鼠相似，具有Mex3a遺傳缺陷的Mex3a-/-小鼠的胸主動(dòng)脈顯示較少的帶有核Ago2染色的EC（圖7Q），并且原位RNA雜交顯示出miR-126-5p + EC的顯著減少（圖7R和S）。相反，在Mex3a-/-小鼠中，活性形式的caspase-3的核染色增加（圖7T）。在人的頸動(dòng)脈樣本中，在非患病區(qū)域與動(dòng)脈粥樣硬化區(qū)域相比，miR-126-5p和caspase-3的緊密定位信號(hào)檢出率更高（圖7U和V）?？傮w而言，這些數(shù)據(jù)支持由內(nèi)皮自噬驅(qū)動(dòng)的核Ago2：Mex-3a：miR-126-5p途徑可在體內(nèi)發(fā)生，以賦予剪切應(yīng)力依賴性動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)作用。

參考文獻(xiàn)：
Santovito Donato., Egea Virginia., Bidzhekov Kiril., Natarelli Lucia., Mour?o André., Blanchet Xavier., Wichapong Kanin., Aslani Maria., Brun?en Coy., Horckmans Michael., Hristov Michael., Geerlof Arie., Lutgens Esther., Daemen Mat J A P., Hackeng Tilman., Ries Christian., Chavakis Triantafyllos., Morawietz Henning., Naumann Ronald., von Hundelshausen Philipp., Steffens Sabine., Duchêne Johan., Megens Remco T A., Sattler Michael., Weber Christian.(2020). Noncanonical inhibition of caspase-3 by a nuclear microRNA confers endothelial protection by autophagy in atherosclerosis. Sci Transl Med, 12(546), undefined. doi:10.1126/scitranslmed.aaz2294