MIR106A-5p與鼻咽癌進(jìn)展

    調(diào)節(jié)失調(diào)的microRNAs（miRNAs）與腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)。MIR106A-5p在細(xì)胞遺傳學(xué)上定位于Xq26.2，在不同的癌癥中作為癌基因和抑癌基因。然而，MIR106A-5p致癌作用的調(diào)控機(jī)制尚未闡明。今天小編為大家?guī)戆l(fā)表于“Autophagy”上的文章：“MIR106A-5p upregulation suppresses autophagy and accelerates malignant phenotype in nasopharyngeal carcinoma”，給大家詳細(xì)介紹MIR106A-5p如何參與鼻咽癌（NPC）進(jìn)展。

    我們使用miRNA芯片來表征鼻咽癌組織中MIR106A-5p的表達(dá)水平，通過臨床資料確定MIR106A-5p與患者預(yù)后的關(guān)系，后續(xù)實驗證實了MIR106A-5p在鼻咽癌中調(diào)節(jié)惡性腫瘤和自噬的機(jī)制。最后，我們研究了MIR106A-5p是如何在NPC中上調(diào)的。
結(jié)果：
1.MIR106A-5p在鼻咽癌中的表達(dá)及臨床意義
    我們使用聯(lián)合的GEO隊列數(shù)據(jù)庫檢測NPC miRNAs的表達(dá)譜。這些數(shù)據(jù)表明，在差異表達(dá)的miRNAs中，MIR106A-5p在鼻咽癌組織中顯著增加了4.8倍。qRT-PCR證實了MIR106A-5p在鼻咽癌組織中的過表達(dá)（圖1A）。此外，MIR106A-5p在鼻咽癌細(xì)胞系中的表達(dá)顯著增加，尤其是CNE-2和5-8F細(xì)胞系（圖1B）。其次， ISH顯示，臨床IV期NPC患者的MIR106A-5p過表達(dá)比臨床I-III期NPC患者更為突出（圖1C，D），這表明MIR106A-5p的失調(diào)可能與終末期NPC密切相關(guān)。生存率分析表明，MIR106A-5p高表達(dá)患者的臨床預(yù)后比MIR106A-5p低表達(dá)的患者差（圖1E）?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明鼻咽癌進(jìn)展與MIR106A-5p上調(diào)有關(guān)。

2.MIR106A-5p加速鼻咽癌惡性表型的形成
    我們采用斑馬魚和BALB/c小鼠動物模型檢測MIR106A-5p的體內(nèi)功能。我們發(fā)現(xiàn)MIR106A-5p的敲除顯著抑制了CNE-2細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力（圖2A，B）。MIR106A-5p敲除后鼻咽癌細(xì)胞的遷移減少（圖2C，D）。在皮下注射高或低MIR106A-5p表達(dá)的CNE-2細(xì)胞后測量腫瘤大小，注射MIR106A-5p低表達(dá)細(xì)胞的小鼠腫瘤生長減少（圖2E，F(xiàn)）。這些發(fā)現(xiàn)共同提供了MIR106A-5p加速鼻咽癌轉(zhuǎn)移和生長的證據(jù)。IHC分析顯示，低表達(dá)MIR106A-5p的異種移植可增加MAP1LC3B的表達(dá)水平（圖2F，G），MAP1LC3B的表達(dá)水平與鼻咽癌異種移植瘤中MKI67（增殖標(biāo)記物ki-67）的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（圖2H）。

3.MIR106A-5p抑制鼻咽癌細(xì)胞自噬
    我們假設(shè)MIR106A-5p表達(dá)失調(diào)可能影響自噬。因此，我們評價了MIR106A-5p對自噬體和自溶體生成的影響。值得注意的是，沉默MIR106A-5p的表達(dá)顯著促進(jìn)了ATG基因的表達(dá)，并誘導(dǎo)自噬通量產(chǎn)生自噬體和/或自溶體（圖3A，I），這表明MIR106A-5p能有效地抑制鼻咽癌細(xì)胞的自噬。

4.MIR106A-5p通過抑制自噬作用加速鼻咽癌惡性表型
    通過評估ATG5基因敲除后細(xì)胞的生長和遷移能力，研究了MIR106A-5p抑制的自噬在鼻咽癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移中的作用。敲除ATG5顯著降低MIR106A-5p抑制誘導(dǎo)的自噬（圖4A）。由于三維細(xì)胞培養(yǎng)模型更接近體內(nèi)腫瘤微環(huán)境，因此三維NPC細(xì)胞培養(yǎng)被用來評估細(xì)胞的活性和增殖。沉默MIR106A-5p表達(dá)可減少球體的形成和細(xì)胞生存能力，這個表型部分地被抑制ATG5所挽救（圖4B）。此外，在ATG5被抑制后，MIR106A-5p海綿體內(nèi)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)移和生長減少被消除（圖4C-E）。這些發(fā)現(xiàn)表明MIR106A-5p抑制的自噬加速了惡性鼻咽癌的表型（圖4F）。

5.BTG3是MIR106A-5p的直接靶點(diǎn)，與頭頸部癌預(yù)后不良相關(guān)
    通過四種常見的生物信息學(xué)工具來確定MIR106A-5p的自噬相關(guān)靶點(diǎn)（圖5A，B）。在這些靶基因中，BTG3具有MIR106A-5p潛在的高親和力結(jié)合位點(diǎn)（圖5C）。熒光素酶報告分析顯示MIR106A-5p和BTG3 3′-UTR之間具有生物有效相互作用（圖5D）。此外，鼻咽癌組織中BTG3 mRNA和BTG3蛋白表達(dá)降低（圖5E）。有趣的是，在MIR106A-5p抑制后，BTG3蛋白水平顯著增加，而BTG3的mRNA水平保持不變（圖5F-I）。鼻咽癌組織芯片中MIR106A-5p表達(dá)與BTG3蛋白水平呈負(fù)相關(guān)（圖5J）。這些結(jié)果表明MIR106A-5p可能通過翻譯抑制來調(diào)節(jié)BTG3的表達(dá)。最后，Kaplan-Meier分析顯示，在鼻咽癌組織芯片中，低BTG3水平與較差的臨床結(jié)果相關(guān)（圖5K）。總的來說，這些數(shù)據(jù)表明MIR106A-5p通過靶向BTG3直接調(diào)節(jié)自噬。

6.BTG3對MIR106A-5p抑制自噬是必不可少的
    通過用siRNA轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)BTG3參與了MIR106A-5p相關(guān)的自噬抑制（圖6A-E）。一系列分析表明，BTG3的敲除消除了MIR106A-5p抑制增加自噬的能力（圖6A-E），證明MIR106A-5p抑制自噬依賴于其降低BTG3水平的能力。

7.BTG3對MIR106A-5p加速惡性鼻咽癌表型至關(guān)重要
    為了進(jìn)一步證實MIR106A-5p-BTG3軸導(dǎo)致惡性腫瘤加速，對MIR106A-5p海綿處理的鼻咽癌細(xì)胞進(jìn)行慢病毒BTG3 shRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)。MIR106A-5p抑制降低了鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和生長，但這些作用在BTG3基因敲除后顯著降低（圖7A-E）。IHC分析顯示，惡性表型加速的鼻咽癌異種移植組的自噬也減少（圖7F-K），這表明MIR106A-5p的自噬抑制和促腫瘤作用需要BTG3（圖7L）。

8.MIR106A-5p-BTG3軸通過MAPK途徑抑制自噬
    接下來，我們試圖確定參與MIR106A-5p誘導(dǎo)自噬的BTG3相互作用蛋白。我們對MIR106A-5p靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG途徑分析后，確定了MAPK和AKT-MTOR通路。因此，使用這些途徑的抑制劑進(jìn)行拯救實驗來研究這些途徑對MIR106A-5p-BTG3介導(dǎo)的腫瘤進(jìn)展的相對貢獻(xiàn)。我們發(fā)現(xiàn)，只有用PD184352抑制MAP2K1/MEK活性才能顯著抑制由MIR106A-5p和BTG3沉默誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和遷移；相比之下，MK2206抑制AKT活性未能改變MIR106A-5p-BTG3介導(dǎo)的腫瘤生長和遷移（圖8A-D）。此外，我們還檢測了鼻咽癌的MIR106A-5p-BTG3軸依賴性自噬抑制是否由MAPK信號的激活引起。當(dāng)MIR106A-5p抑制或BTG3表達(dá)激活自噬時，p-MAP2K1和下游p-MAPK1/ERK和p-MTOR水平降低。在用PD184352抑制MAP2K1活性后，MIR106A-5p和BTG3敲除細(xì)胞中的p-MAP2K1、p-MAPK1和p-MTOR水平和ATG表達(dá)被挽救（圖8E），這表明激活的MAPK信號部分負(fù)責(zé)NPC中MIR106A-5p-BTG3軸抑制自噬。

9.鼻咽癌中MIR106A-5p上調(diào)是EGR1和SOX9增加反式激活的結(jié)果
    我們檢查了MIR106A-5p在鼻咽癌中是如何上調(diào)的。對MIR106A-5p啟動子的序列分析確定了EGR1和SOX9分別位于?136和?1472處（圖9A），表明EGR1和SOX9調(diào)節(jié)MIR106A-5p的轉(zhuǎn)錄。值得注意的是，在鼻咽癌細(xì)胞系中，EGR1和SOX9均上調(diào)（圖9B）。沉默EGR1和SOX9表達(dá)降低MIR106A-5p水平，并且EGR1和SOX9的過表達(dá)增加了MIR106A-5p水平（圖9C-E）。此外，熒光素酶報告分析和染色質(zhì)免疫沉淀分析表明，EGR1和SOX9都直接與MIR106A-5p啟動子的預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，并反式激活MIR106A-5p（圖9F-H）。應(yīng)用IHC和ISH法對鼻咽癌組織中SOX9和MIR106A-5p表達(dá)的相關(guān)性表明，SOX9的表達(dá)與MIR106A-5p水平呈正相關(guān)（圖9I）。鼻咽癌生存分析組織微陣列進(jìn)一步顯示，與低表達(dá)SOX9的鼻咽癌患者相比，SOX9高表達(dá)患者的預(yù)后較差（圖9J）。GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫分析也證實了這些預(yù)測結(jié)果（圖9K）。這些結(jié)果表明MIR106A-5p在鼻咽癌中的過表達(dá)是由于EGR1和SOX9增加了反式激活。

結(jié)論：
    本研究揭示MIR106A-5p在鼻咽癌自噬和促進(jìn)惡性表型中的作用。在鼻咽癌中，MIR106A-5p通過靶向BTG3和激活自噬調(diào)節(jié)MAPK信號通路促進(jìn)惡性表型。我們的結(jié)果表明MIR106A-5p的定量在治療前預(yù)測復(fù)發(fā)率和生存率是有用的。綜上所述，我們的發(fā)現(xiàn)可以為自噬相關(guān)鼻咽癌治療的臨床應(yīng)用提供新的見解。