單細(xì)胞RNA測序簡直不要太強(qiáng)悍！分分鐘揭示腫瘤浸潤NK細(xì)胞的機(jī)制

    在癌癥的免疫治療中如何提高免疫細(xì)胞的功能仍然是臨床醫(yī)學(xué)的重要挑戰(zhàn)。缺氧是實(shí)體腫瘤的共同特征，細(xì)胞通過上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α適應(yīng)缺氧環(huán)境。本文通過使用單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）技術(shù)揭示了小鼠腫瘤浸潤自然殺傷（NK）細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜，并于2020年6月16日發(fā)表在Immunity（IF：22.553）期刊上。
圖解摘要如下：
A. NK細(xì)胞缺乏HIF-1α?xí)档湍[瘤的生長；
B. 單細(xì)胞RNA測序技術(shù)揭示腫瘤中HIF-1α-/-NK細(xì)胞被激活；
C. IL-18驅(qū)動(dòng)HIF-1α-/-NK細(xì)胞中NK-kB、Ikb和Ifng高表達(dá)；
D. NK-IL18-IFNGhi特征與癌癥患者生存率的增加相關(guān)。

結(jié)果如下：
1、HIF1a缺失的NK細(xì)胞展現(xiàn)出抗腫瘤活性和抑制腫瘤生長的潛力
    實(shí)體腫瘤具有缺氧特征，這可以重塑免疫細(xì)胞的功能，為了探究HIF-1α在長時(shí)間暴露于缺氧和實(shí)體腫瘤組織中調(diào)節(jié)NK細(xì)胞響應(yīng)中的作用，作者構(gòu)建了NKp46+細(xì)胞HIF-1α缺失的小鼠，并發(fā)現(xiàn)HIF-1α敲除不改變NK細(xì)胞在不同器官中的數(shù)量或成熟分化標(biāo)志物CD27和CD11b的表達(dá)，如脾臟，血液，肺和肝等。
    為了進(jìn)一步探究HIF1a缺失的NK細(xì)胞的抗腫瘤活性，作者構(gòu)建了不同類型的腫瘤模型，然后檢測發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，HIF1a缺失的NK細(xì)胞小鼠中的腫瘤大小顯著下降，而MHC缺失對(duì)照組的腫瘤大小則沒有明顯改變（圖1A）。與此一致的是，HIF1a缺失的NK細(xì)胞小鼠的脾臟中NK細(xì)胞具有更高的IFN-g和granzyme B的表達(dá)，并對(duì)腫瘤細(xì)胞變現(xiàn)出更強(qiáng)的異常調(diào)控（圖1B）。隨后作者注射了肺癌細(xì)胞重現(xiàn)了上述研究（圖1C）。為了檢測HIF1a缺失的NK細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)在潛能，作者將HIF1a缺陷的NK細(xì)胞轉(zhuǎn)入敲除T、B、NK細(xì)胞的Rag2-/-Il2rg-/-小鼠體內(nèi)，再接種腫瘤細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這導(dǎo)致腫瘤生長顯著下降（圖1D），表明HIF-1α具有細(xì)胞內(nèi)在調(diào)控NK細(xì)胞抗腫瘤活性的功能。

圖1 NK細(xì)胞HIF1a缺失導(dǎo)致腫瘤生長減少

2、腫瘤浸潤NK細(xì)胞的高通量scRNA-seq發(fā)現(xiàn)在Hif1a - / -小鼠中發(fā)現(xiàn)一個(gè)獨(dú)特的NK效應(yīng)亞群
    本文中高通量scRNA-Seq共分析了5721個(gè)NK細(xì)胞，3075個(gè)來自WT小鼠，2646個(gè)來自HIF-1α缺失小鼠，并分別從野生型和HIF-1α缺失NK細(xì)胞中鑒定到1763和1563個(gè)轉(zhuǎn)錄本。對(duì)所有細(xì)胞進(jìn)行無差別聚類，共聚成6類，而野生型和HIF-1α缺失NK細(xì)胞明顯具有不同分布（圖2B-C）。值得注意的是，HIF-1α缺失NK細(xì)胞約有近60%聚為1和4類種群，而在1和4類種群中大約有90%的細(xì)胞是來源于HIF-1α缺失NK細(xì)胞（圖2D-E）。與此相反，野生型NK細(xì)胞大多分布在2，3，5，6類群中。此外，來自1，2，3類群中的細(xì)胞明顯分為Cd11blowCd27high兩種趨勢分布，而來自4，5，6類群中的細(xì)胞明顯分為Cd11bhighCd27low兩種趨勢分布（圖2F-G）。其余的幾種基因表達(dá)也發(fā)現(xiàn)了類似的情況，如f Klrg1, Ncr1 (NKp46), Klrb1c (NK1.1), Itga2 (CD49b, DX5), Klra3 (Ly49C), and Klra9 (Ly49I)。另外，1，2，3類群中的細(xì)胞部分轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)增加，如PD-1，TIGIT，CTLA4（圖2G）。而趨化因子Ifng和CD69在HIF-1α缺失NK細(xì)胞上調(diào)（圖2H）。在4類群中，占總細(xì)胞總數(shù)10%的WT NK細(xì)胞也表現(xiàn)出Hif1a的低表達(dá)(圖2I)。在WT NK細(xì)胞中，Hif1a及其靶基因的低表達(dá)與Ifng轉(zhuǎn)錄升高相關(guān)(圖2I)，說明Hif1a在調(diào)節(jié)NK細(xì)胞激活和效應(yīng)功能方面的負(fù)作用。

圖2 腫瘤浸潤NK細(xì)胞的高通量scRNA-Seq顯示Hif1a - / -簇具有獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄特征

    隨后，作者分析了上述差異表達(dá)基因的通路富集情況，發(fā)現(xiàn)HIF-1α缺失NK細(xì)胞富集于NF-kB通路，或者涉及到NF-kB激活的其它通路（圖3A）。其中包括轉(zhuǎn)錄本NFkB1（p50 / p105）（Nfkb1），RelA（p65）（Rela）和其他NF-kB家族成員的轉(zhuǎn)錄本，例如NF-kB2（p52 / p100）（Nfkb2），c-Rel（Rel） 和RelB（Relb）（圖3B）。此外，還報(bào)道了編碼IkBz的NF-kB靶基因Nfkbiz的表達(dá)，IkBz是一種據(jù)報(bào)道在細(xì)胞因子刺激后可驅(qū)動(dòng)NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-g的核因子（圖3C和2F）。其他NF-kB靶基因，例如Nfkbia，Nr4a1，Ccl3，Ccl4和Icam1，主要在類群4中共表達(dá)（圖3C和2F）。重要的是，NF-kB激活的這種富集與Ifng基因的高表達(dá)（圖3D）以及NK細(xì)胞活化特征相關(guān)（圖3E）。為了證實(shí)HIF-1α缺失的腫瘤浸潤NK細(xì)胞中NF-kB途徑的激活，使用流式細(xì)胞儀確定了磷酸化的p65（p-p65），p50和IkBz的表達(dá)。結(jié)果證實(shí)與WT腫瘤浸潤NK細(xì)胞相比，HIF1a缺失中NK細(xì)胞中p-p65和p50表達(dá)增加以及IkBz的誘導(dǎo)增加（圖3F）。

圖3 scRNA-seq識(shí)別腫瘤中活化的HIF1a - / - NK細(xì)胞亞群

3、HIF1a - / - NK細(xì)胞的抗腫瘤活性依賴于骨髓細(xì)胞來源的IL-18
    為了探索驅(qū)動(dòng)腫瘤浸潤的Hif1a - / - NK細(xì)胞中增強(qiáng)NF-kB活性的因素，分析了全腫瘤組織中的細(xì)胞因子和趨化因子轉(zhuǎn)錄譜。 與scRNA-seq數(shù)據(jù)一致，與WT小鼠相比，Ifng是Hif1af / fNcr1iCreTg小鼠腫瘤組織中表達(dá)最高的轉(zhuǎn)錄物（圖4A）。腫瘤細(xì)胞分類分析和腫瘤浸潤免疫細(xì)胞顯示II18轉(zhuǎn)錄主要存在于腫瘤浸潤免疫細(xì)胞中，如單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，而樹突狀細(xì)胞在較低的范圍內(nèi)表現(xiàn)出II18的高表達(dá)（圖4B）。觀察到腫瘤組織中IL-18蛋白含量與基因型無關(guān)（圖4C），表明IL-18的可用性在這些腫瘤之間沒有差異。
    但是，與WT NK細(xì)胞相比，包含IL-18受體（IL-18R）下游信號(hào)分子（包括IkBz和其他NF-kB家族成員）的IL-18途徑在Hif1a缺陷NK細(xì)胞中含量很高（圖4D）。因此，通過使用mAb注射中和IL-18來研究IL-18在RMA-S腫瘤控制中的作用。在野生型小鼠中，IL-18的中和作用不會(huì)改變腫瘤的生長（圖4E）。相反，抗IL-18 mAb的應(yīng)用消除了Ifng是Hif1af/f Ncr1iCreTg小鼠中腫瘤的延遲生長（圖4E）。一致地，與對(duì)照小鼠相比，IL-18中和作用降低了來自Ifng是Hif1af / fNcr1iCreTg的腫瘤浸潤NK細(xì)胞中pp65和p50的表達(dá)，并消除了IkBz的上調(diào)（圖4F）?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)表明，缺乏HIF-1a可以增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)IL-18的反應(yīng)能力，這是控制Ifng是Hif1af / fNcr1iCreTg小鼠腫瘤生長所必需的。

圖4 HIF1a -/- NK細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤活性依賴于髓細(xì)胞來源的IL-18

4、小鼠NK中HIF-1a抑制導(dǎo)致效應(yīng)功能增強(qiáng)和細(xì)胞代謝提高
    為了進(jìn)一步證實(shí)HIF1a -/- NK細(xì)胞中IL-18誘導(dǎo)的效應(yīng)功能機(jī)制，在1%氧氣的缺氧條件下培養(yǎng)脾臟HIF1a -/- NK細(xì)胞和WT NK細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與WT相比，IL-12和IL-18刺激后，缺氧暴露的HIF1a -/- NK細(xì)胞中IFN-γ的產(chǎn)量更高（圖5B）。使用藥理抑制劑TPCA-1抑制NF-kB激活能完全阻斷IFN-γ的產(chǎn)生（圖5C），而不影響細(xì)胞活力和下游IL-18R的產(chǎn)量。這些表明NF-kB通路參與IL-18暴露中NK細(xì)胞的多種效應(yīng)功能調(diào)控。
    據(jù)報(bào)道HIF-1α調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞分化和效應(yīng)功能而參與細(xì)胞代謝。與代謝激活的WT相比，HIF-1α缺失NK細(xì)胞暴露于延遲缺氧7天，氧氣消耗速率（OCR）沒有顯著差異，而暗示糖酵解的細(xì)胞外的酸化速率（ECAR）在后者中顯著下降（圖5D）。經(jīng)IL-12和IL-18刺激后，ECAR升高至相似值，而OCR值在HIF-1α-/-NK細(xì)胞中較高。OCR升高，因此OCR/ECAR比例升高，與HIF-1α-/-NK細(xì)胞的IFN-γ產(chǎn)量提高有關(guān)（圖5E）。因此，缺氧暴露的HIF-1α-/-NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的能力增強(qiáng)與NF-kB途徑的激活和代謝改變有關(guān)。

圖5 HIF1a缺失的NK細(xì)胞經(jīng)刺激后IFN-γ的產(chǎn)生增強(qiáng)與NF-kB通路激活和耗氧率增加有關(guān)

5、HIF-1α抑制導(dǎo)致激活的人NK細(xì)胞效應(yīng)響應(yīng)增強(qiáng)
    為了研究抑制HIF-1α是否能以類似的方式增強(qiáng)人NK細(xì)胞的效應(yīng)功能，用小分子化合物KC7F2，據(jù)報(bào)道可以抑制HIF-1α蛋白的穩(wěn)定性和其靶基因轉(zhuǎn)錄，處理純化的人外周血NK細(xì)胞。結(jié)果顯示，人NK細(xì)胞使用KC7F2處理后在IL-2存在的情況下，顯著增強(qiáng)了細(xì)胞脫粒作用以及IFN-γ和TNF-α的產(chǎn)生（圖6A）。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了HIF-1α抑制劑誘導(dǎo)高功能性人NK細(xì)胞的潛力。為了探究HIF-1α是否能夠影響人NK細(xì)胞抗腫瘤響應(yīng)，分析了NK細(xì)胞浸潤非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜。作者發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤NK細(xì)胞表現(xiàn)出HIF1A高表達(dá)。這與其靶基因上調(diào)和IFNG下調(diào)的相關(guān)（圖6B）。與腫瘤周圍部位相比，NK-IL18-IFNG信號(hào)降低，進(jìn)一步支持了NK細(xì)胞效應(yīng)功能在腫瘤中的負(fù)調(diào)控，這與單個(gè)NK細(xì)胞中HIF1A的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(圖6C)。這些結(jié)果表明人腫瘤浸潤NK細(xì)胞的癌癥病人中HIF1A表達(dá)與他們的抗腫瘤潛力呈負(fù)相關(guān)。

圖6 HIF-1a在人NK細(xì)胞中的激活與抗腫瘤活性的降低相關(guān)

6、一個(gè)NK-IL18-IFNG信號(hào)預(yù)測改善不同癌癥病人總體生存率
    本文中，腫瘤微環(huán)境中IL-18的存在導(dǎo)致NK細(xì)胞反應(yīng)增強(qiáng)，這由NF-kB激活和Ifng表達(dá)表明，而沒有HIF-1a，則導(dǎo)致腫瘤生長減少。因此，單個(gè)人腫瘤浸潤NK細(xì)胞中的NK-IL18-IFNG信號(hào)與HIF1A表達(dá)負(fù)相關(guān)。因此，分析了人類腫瘤樣品中的整體NK-IL18-IFNG信號(hào)是否可預(yù)測癌癥患者存活率的提高。對(duì)來自TCGA數(shù)據(jù)集的皮膚黑色素瘤（SKCM）的469位患者樣品的分析顯示，SKCM腫瘤中IL18和IFNG基因表達(dá)呈正相關(guān)（圖7A）。此外，NK細(xì)胞相關(guān)基因（NCR1，NCR3，KLRB1，CD160和PRF1）的表達(dá)與IL18-IFNG基因表達(dá)呈正相關(guān)（圖7B）。重要的是，與SKCM患者中的NK-IL18-IFNGlow信號(hào)相比，NK-IL18-IFNGhigh信號(hào)的SKCM患者與更好的總體存活率相關(guān)（圖7C）。在乳腺癌（BRCA，n = 1,093）和宮頸癌（CESC，n = 304）患者中發(fā)現(xiàn)了相似的相關(guān)性（圖7D-7I）。這些數(shù)據(jù)表明NK-IL18-IFNG標(biāo)記在不同癌癥實(shí)體中可能的預(yù)后作用。

圖7 在不同的腫瘤中，NK-IL18-IFNG的特征與提高患者的總體生存率相關(guān)

    總之，本文的結(jié)果提高了對(duì)HIF-1a介導(dǎo)的控制NK細(xì)胞效應(yīng)功能在其微環(huán)境中的機(jī)制理解。本文的數(shù)據(jù)表明，IL-18供應(yīng)與NK特異性HIF-1a靶向的組合方法有望改善NK細(xì)胞敏感性實(shí)體瘤的治療策略。
參考文獻(xiàn)：
Ni Jing., Wang Xi., Stojanovic Ana., Zhang Qin., Wincher Marian., Bühler Lea., Arnold Annette., Correia Margareta P., Winkler Manuel., Koch Philipp-Sebastian., Sexl Veronika., H?fer Thomas., Cerwenka Adelheid.(2020). Single-Cell RNA Sequencing of Tumor-Infiltrating NK Cells Reveals that Inhibition of Transcription Factor HIF-1α Unleashes NK Cell Activity. Immunity, 52(6), 1075-1087.e8. doi:10.1016/j.immuni.2020.05.001