lncRNA INCR1調(diào)節(jié)IFNγ信號(hào)逃避腫瘤免疫

導(dǎo)讀：
        免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療是基于腫瘤上調(diào)免疫檢查點(diǎn)分子（如PD-L1）來逃避抗腫瘤免疫的能力，然而部分應(yīng)答者對(duì)這些療法出現(xiàn)獲得性耐藥。免疫檢查點(diǎn)抑制劑的耐藥部分是由于腫瘤中IFN刺激基因的持續(xù)表達(dá)，導(dǎo)致持續(xù)的IFNγ信號(hào)傳導(dǎo)。lncRNA轉(zhuǎn)錄過程本身可以促進(jìn)染色質(zhì)重塑，增強(qiáng)編碼基因啟動(dòng)子的活性。研究顯示lncRNA的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但它們在免疫逃避中的作用仍不清楚。Mineo等人在下面這篇文章中研究了lncRNA INCR1在腫瘤免疫逃避中的作用。

技術(shù)路線圖：

結(jié)果：
1.lncRNA INCR1在IFNγ刺激的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)
        首先對(duì)IFNγ刺激的患者源性GBM細(xì)胞株(PDGCLs)進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組分析(RNA測序，F(xiàn)igure 1A)，IFNγ刺激了113個(gè)lncRNA的轉(zhuǎn)錄，包括已經(jīng)被驗(yàn)證的IFNγ刺激之后上調(diào)的lncRNA BANCR。在上調(diào)最顯著的lncRNA中，有一個(gè)表達(dá)于PD-L1/PD-L2位點(diǎn)DNA鏈的lncRNA特征不明顯，命名為lncRNA INCR1(Figure 1B)。INCR1表達(dá)與237個(gè)lncRNAs表達(dá)呈正相關(guān)( Figure 1C)，其中幾個(gè)轉(zhuǎn)錄于受IFN調(diào)控的編碼蛋白質(zhì)的基因座(Figure 1D)。PhyloCSF對(duì)INCR1序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該轉(zhuǎn)錄本具有低編碼潛力( (Figure 1E))。通過體外轉(zhuǎn)錄/翻譯實(shí)驗(yàn)，文章也證實(shí)了INCR1沒有被翻譯成蛋白( (Figure 1F)。qPCR分析顯示，INCR1主要定位在細(xì)胞核內(nèi)(Figure 1G)。分析INCR1位點(diǎn)和附近的9p21細(xì)胞帶，包括CDKN2A/B基因，在32個(gè)PDGCLs和43個(gè)長期GBM細(xì)胞系(LTGCLs)中，顯示了與來自癌癥基因組圖譜(TCGA)隊(duì)列的GBM腫瘤相似的拷貝數(shù)改變模式，這表明實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞系模型反映了人類疾病。

2.在不同的癌細(xì)胞和病人的腫瘤中，INCR1表達(dá)與PD-L1水平相關(guān)
        對(duì)PDGCLs 進(jìn)行qPCR分析發(fā)現(xiàn)在所有的細(xì)胞系中，IFNγ刺激INCR1上調(diào) (Figure 2A)。IFNγ處理的PDGCLs也表達(dá)高水平的PD-L1 mRNA和蛋白(Figure 2B)。值得注意的是，我們觀察到INCR1和PD-L1 mRNA和蛋白之間高度顯著的相關(guān)性(Figure 2C)。與這些發(fā)現(xiàn)相一致的是，INCR1在患者GBMs中表達(dá)與PD-L1 mRNA水平呈正相關(guān)，INCR1高的腫瘤也表達(dá)較高的PD-L1水平(Figure 2D and 2F)。實(shí)驗(yàn)選擇6個(gè)代表GBM、黑色素瘤、NSCLC和BC的細(xì)胞系。IFNγ刺激后，所有細(xì)胞系均顯示INCR1表達(dá)增加(Figure 2G)，這也與PD-L1表達(dá)相關(guān)(Figures 2H and 2I). 因此，說明文章發(fā)現(xiàn)了腫瘤和組織培養(yǎng)細(xì)胞中一種新的lncRNA，IFN刺激其表達(dá)，其表達(dá)與PD-L1呈正相關(guān)。

3.INCR1調(diào)節(jié)腫瘤IFNγ信號(hào)通路
        作者推測INCR1會(huì)調(diào)節(jié)其鄰近基因的表達(dá)和IFNγ刺激引起的腫瘤應(yīng)答。沉默INCR1降低了938個(gè)基因的表達(dá)，其中451個(gè)基因在未受刺激和IFNγ刺激的細(xì)胞中普遍下調(diào)(Figure 3A )?；虮倔w論(GO)富集分析顯示下調(diào)的基因參與免疫相關(guān)功能，如IFNγ應(yīng)答、先天免疫應(yīng)答和對(duì)病毒的防御應(yīng)答(Figure 3B)。此外，INCR1基因敲低導(dǎo)致124個(gè)ISGs基因表達(dá)減少(Figure 3C)。這些基因中包括IFNγ信號(hào)通路的重要組成部分(JAK2，STAT1)，以及主要的免疫抑制分子(PD-L1和IDO1)。研究證實(shí)，無論是在基礎(chǔ)水平上還是在IFNγ作用下，沉默INCR1都會(huì)導(dǎo)致其重疊基因PD-L1和PDL2的mRNA水平降低(Figure 3D 3F)。值得注意的是，與INCR1和PD-L1在同一位點(diǎn)的JAK2的mRNA顯著下調(diào)(Figure 3G)，來自不同基因組區(qū)域的ISGs如STAT1和IDO1的mRNA也顯著下調(diào)(Figure 3H和3I)。此外，文章中證明了沉默INCR1導(dǎo)致PD-L1、JAK2、STAT1和IDO1蛋白水平下調(diào)(Figure 3J)?？係TAT1的下調(diào)與IFNγ刺激下其磷酸化和核定位降低相關(guān)(Figure 3J）。此外，我們發(fā)現(xiàn)沉默INCR1降低了PD-L1總蛋白和細(xì)胞表面PD-L1水平。

4.體外沉默INCR1導(dǎo)致T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性增加；體內(nèi)提高CAR-T細(xì)胞療效
        研究表明CD8+ CTLs的激活誘導(dǎo)IFNγ等細(xì)胞因子的分泌，促進(jìn)其增殖和抗腫瘤活性。將腫瘤細(xì)胞與CD8 + CTL共培養(yǎng)，用antiCD3和anti-CD28抗體共價(jià)偶聯(lián)的珠子激活，會(huì)使INCR1沉默細(xì)胞的細(xì)胞毒性比對(duì)照組增加，但活化T細(xì)胞的生存能力沒有顯著變化(Figure 4A)。使用3D培養(yǎng)系統(tǒng)，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)INCR1敲除腫瘤球與激活的CD8+ ctl共孵養(yǎng)時(shí)顯著減小，與對(duì)照腫瘤球相比(Figure 4B)。這與INCR1沉默細(xì)胞共培養(yǎng)的CD8+ CTLs中IFNγ分泌增加有關(guān)，與CD8+ CTLs共培養(yǎng)的空白細(xì)胞相比。
        將U251-EGFRvIII對(duì)照和INCR1沉默腫瘤植入皮下。植入后7天，單獨(dú)表達(dá)GFP的人T細(xì)胞(對(duì)照組)或EGFRvIII-directed CAR被單次靜脈注射為標(biāo)準(zhǔn)劑量的1/10。在這些條件下，對(duì)照組腫瘤小鼠對(duì)CAR-T細(xì)胞治療沒有明顯反應(yīng)。相比之下，CAR-T細(xì)胞顯著降低了INCR1敲低腫瘤小鼠的腫瘤生長。在研究結(jié)束時(shí)，也就是注射T細(xì)胞后的21天，我們對(duì)腫瘤進(jìn)行了CAR - T細(xì)胞存在的分析。INCR1敲除腫瘤同時(shí)出現(xiàn)CD4+和CD8+ T細(xì)胞浸潤，以CD8+ T細(xì)胞為主。相比之下，對(duì)照組腫瘤未見CD4+ T細(xì)胞浸潤(Figure 4E，4F)。此外，與INCR1沉默的浸潤性腫瘤相比，對(duì)照組的CD8+ T細(xì)胞表達(dá)的PD-1水平明顯更高(Figure 4G)。這些結(jié)果表明INCR1在控制腫瘤IFNγ信號(hào)中發(fā)揮著功能作用，其敲除導(dǎo)致人類腫瘤細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷的敏感性增加。

5.HNRNPH1是INCR1的結(jié)合搭檔
        大多數(shù)lncrna通過與蛋白質(zhì)相互作用而發(fā)揮作用。為了明確INCR1調(diào)控PD-L1表達(dá)的機(jī)制，我們采用RNA反義純化(RAP)對(duì)IFNγ刺激的PDGCLs中與內(nèi)源性INCR1直接接觸的蛋白進(jìn)行純化。我們設(shè)計(jì)了覆蓋整個(gè)INCR1序列的探針，通過UV照射交聯(lián)RNA -蛋白復(fù)合物，并在變性條件下進(jìn)行RAP，以最大限度地恢復(fù)特定RNA-蛋白相互作用。與對(duì)照純化相比，我們觀察到大于80倍的INCR1 RNA富集((Figure 5A)。質(zhì)譜分析顯示，在INCR1 RAP中，HNRNPH1蛋白結(jié)合最高，而在對(duì)照RAP中則不是(Figure 5B)。然后，我們通過體內(nèi)RNA UV交聯(lián)和免疫沉淀(CLIP)驗(yàn)證了INCR1和HNRNPH1之間的相互作用。此外，與未處理的細(xì)胞和同型對(duì)照相比，IFNγ刺激的細(xì)胞中HNRNPH1與INCR1顯著結(jié)合(Figure 5C)。為了識(shí)別HNRNPH1結(jié)合的INCR1區(qū)域，我們首先通過增強(qiáng)剪輯測序(eclipseq)繪制了體內(nèi)HNRNPH1結(jié)合位點(diǎn)。我們在INCR1的近端內(nèi)含子上發(fā)現(xiàn)了一簇峰 (Figure 5D)。
        為了在體外驗(yàn)證測序數(shù)據(jù)，我們克隆了一個(gè)包含第一個(gè)內(nèi)含子50和30區(qū)域的INCR1小基因，并利用它生成了7個(gè)不同的體外轉(zhuǎn)錄的生物素化RNA。RNA pull-down分析顯示，HNRNPH1與包含在eclipseq中發(fā)現(xiàn)的主要峰序列的2個(gè)RNA片段(F4和F6)相互作用強(qiáng)烈(Figure 5E)。HNRNPH1結(jié)合的兩個(gè)片段在G-stretches中富集，該基序在80%的HNRNPH1 RNA靶標(biāo)中被發(fā)現(xiàn)(Figure5F)。GO富集分析所有被eCLIP-seq確定的基因，顯示HNRNPH1，除了結(jié)合到INCR1,也結(jié)合到參與免疫系統(tǒng)過程的多個(gè)基因，包括幾個(gè)IFNγ刺激的基因如PD-L1 JAK2和STAT1，它們的表達(dá)受INCR1調(diào)節(jié)(Figure 5G)。接下來，我們通過RNA免疫沉淀(RIP)驗(yàn)證HNRNPH1結(jié)合PD-L1和JAK2 mRNA(Figure 5H 5I)。這些結(jié)果表明INCR1與HNRNPH1的結(jié)合不依賴于PD-L1和JAK2 mRNA的結(jié)合。

6. INCR1是HNRNPH1活性的負(fù)調(diào)控因子
        沉默HNRNPH1可以提高IFNγ處理的A375細(xì)胞((Figure 6A)和患者源性BT139細(xì)胞的PD-L1和JAK2 mRNA水平。這與IFNγ刺激下PD-L1和JAK2蛋白顯著增加有關(guān)(Figure 6B)。這些數(shù)據(jù)提示HNRNPH1是PD-L1和JAK2表達(dá)的負(fù)調(diào)控因子，需要結(jié)合INCR1才能阻止HNRNPH1的功能。在GBM腫瘤(TCGA)中，觀察到HNRNPH1水平與PD-L1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，支持了這一假設(shè)(Figure 6C)。為了進(jìn)一步證明我們的假設(shè)，我們進(jìn)行了敲低實(shí)驗(yàn)來沉默INCR1敲低細(xì)胞中HNRNPH1的表達(dá)。正如預(yù)期的那樣，INCR1敲低導(dǎo)致IFNγ處理的細(xì)胞中PD-L1表達(dá)減少。然而，沉默敲除細(xì)胞中的HNRNPH1挽救了PD-L1的表達(dá)(Figure 6D)。與PD-L1和JAK2 RNA片段相比，INCR1 RNA片段對(duì)HNRNPH1表現(xiàn)出更高的結(jié)合親和力(Figure 6E)。這些數(shù)據(jù)表明，HNRNPH1與INCR1結(jié)合可能會(huì)降低其與PD-L1和JAK2相互作用的能力。利用g-32P放射性標(biāo)記的PD-L1和JAK2 RNA片段，我們觀察到RNA:HNRNPH1復(fù)合物的位移，證實(shí)了這兩個(gè)序列結(jié)合HNRNPH1的能力(Figure 6F)。INCR1:PD-L1和INCR1:JAK2比值為1:1中非標(biāo)記INCR1 RNA片段的添加有效降低PD-L1:HNRNPH1和JAK2:HNRNPH1復(fù)合物的形成(Figure 6F)，表明HNRNPH1與JAK2之間的親和力弱于HNRNPH1與PD-L1之間的親和力。將摩爾比增加到1:5和1:10，復(fù)合物完全解離(Figure 6F)。這些結(jié)果表明INCR1對(duì)HNRNPH1的親和力強(qiáng)于對(duì)PD-L1或JAK2，并且INCR1抑制了HNRNPH1與PDL1和JAK2的相互作用。
        通過ASO H1B（靶向INCR1 RNA中HNRNPH1結(jié)合位點(diǎn)），我們可以在體外以劑量依賴的方式減少INCR1與HNRNPH1的相互作用(Figure 6G)。然而，使用對(duì)照ASO檢測未觀察到對(duì)結(jié)合能力的影響(Figure 6G)。為了研究ASO H1B在體內(nèi)的作用，在ASO轉(zhuǎn)染BT333患者源性細(xì)胞和A375黑色素瘤細(xì)胞中，ASO H1B均顯著降低IFNγ刺激的PD-L1和JAK2蛋白的表達(dá)(Figure 6H)。這些結(jié)果表明INCR1特異性地與HNRNPH1相互作用，阻斷這種相互作用會(huì)影響PD-L1和JAK2的表達(dá)。