SGCE通過EGFR作用于乳腺癌干細(xì)胞

    乳腺癌（BC）是全世界最常見的癌癥，是女性中最主要的癌癥。三陰性乳腺癌（TNBC）是惡性程度高、易轉(zhuǎn)移、高復(fù)發(fā)和預(yù)后差的一類乳腺癌，占所有乳腺癌病例的15%。由于缺少雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮生長因子受體2（HER2）的表達(dá)，TNBC主要治療方式為手術(shù)，放化療，佐以PDL1抑制劑和PARP抑制劑等治療方式?；熕幬锬軌驓⑺勒诜至训哪[瘤細(xì)胞，卻不能有效作用于乳腺癌干細(xì)胞（BCSCs），而BCSCs富集使TNBC對藥物具有耐藥性。目前，腫瘤干細(xì)胞介導(dǎo)的耐藥性是TNBC治療的研究難點(diǎn)之一。最近，中國科學(xué)院昆明動物研究所的陳策實(shí)教授及其團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)SGCE通過穩(wěn)定EGFR的表達(dá)維持乳腺癌干細(xì)胞特性，相關(guān)研究結(jié)果以“SGCE Promotes Breast Cancer Stem Cells by Stabilizing EGFR”為題發(fā)表在Advanced science雜志上，雜志影響因子為15.84。
研究思路：

結(jié)果：
1.SGCE基因在乳腺癌中的表達(dá)特征
    作者通過github網(wǎng)站上的TNBC單細(xì)胞測序結(jié)果以及TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)SGCE與BCSC增殖相關(guān)（A-C），且研究發(fā)現(xiàn)SGCE mRNA和蛋白在CD24lowCD44high細(xì)胞中高表達(dá)（D-E）。作者進(jìn)一步研究了SGCE在BCSCs中的功能，通過流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)TNBC細(xì)胞中，SGCE沉默導(dǎo)致CD24lowCD44high細(xì)胞和ALDH+細(xì)胞比例降低（F-H），同時顯著減少了腫瘤微球數(shù)量和克隆形成能力（I-L）。體外實(shí)驗(yàn)表明SGCE沉默嚴(yán)重降低了腫瘤生成能力（M）。綜上所述， SGCE在體內(nèi)和體外與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。

2.SGCE與藥物抗性的相關(guān)性
    SGCE可以影響乳腺癌干細(xì)胞特性，而腫瘤干細(xì)胞與耐藥相關(guān)，接下來研究了SGCE在化療敏感性中的作用。從化療患者的生存圖可以看出，SGCE表達(dá)水平較低的患者預(yù)后較好(A)。細(xì)胞活力檢測表明SGCE沉默的TNBC細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生較低的細(xì)胞活性劑量（B）。接下來通過腫瘤微球培養(yǎng)和克隆形成試驗(yàn)研究了在使用阿霉素、順鉑和紫杉醇治療后的干細(xì)胞樣活性。藥物治療顯著增加了腫瘤微球和克隆形成數(shù)量，暗示化療顯著富集了乳腺癌干細(xì)胞，在SGCE沉默后富集顯著減少，且SGCE沉默減弱藥物治療抗性（C-J）。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SGCE沉默不能誘導(dǎo)腫瘤體積的顯著性下降，而在阿霉素治療后能顯著抑制腫瘤生長，腫瘤中CD24lowCD44high細(xì)胞比例顯著下降（K-L），表明SGCE低表達(dá)促進(jìn)化療療效提高。

3.SGCE與CAF、ECM相關(guān)性
    TCGA數(shù)據(jù)顯示ECM受體相互作用途徑與SGCE表達(dá)顯著相關(guān)，而SGCE沉默乳腺癌細(xì)胞系的測序結(jié)果顯示ECM受體相互作用途徑富集被減弱（A-B）。通過馬尾松三色染色檢測膠原蛋白，發(fā)現(xiàn)SGCE沉默異種移植瘤組織中膠原蛋白表達(dá)水平顯著減少，而其他ECM成分，包括纖連蛋白、 CD44也顯著減少（C）。RT-PCR顯示了ECM受體基因表達(dá)量顯著降低（D）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)SGCE沉默后細(xì)胞中基質(zhì)與膠原的黏附明顯減少，暗示ECM與其受體之間的相互作用消失（E-F）。作者從患者乳腺腫瘤中提取的成纖維細(xì)胞（CAF）與SGCE沉默的TNBC細(xì)胞共培養(yǎng)時，CAF表現(xiàn)出較低的ECM表達(dá)和較低的硬度，且CAF表現(xiàn)出較弱的遷移能力（G-I）。為了觀察癌細(xì)胞在體內(nèi)招募CAFs的能力，檢測了SGCE沉默的腫瘤中的CAF標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)CAF細(xì)胞標(biāo)志分子（ACTA2、S100A4、S100A2）在癌組織中表達(dá)量顯著性下降（J-K）。

4.SGCE通過EGFR調(diào)控BCSCs和ECM
    為了探討SGCE如何維持BCSCs干細(xì)胞特性，作者分析了 SGCE與其他參與干細(xì)胞特性維持的蛋白之間的表達(dá)相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)EGFR表達(dá)水平與SGCE水平呈正相關(guān)（A）。接下來進(jìn)一步檢測了SGCE是否影響了EGFR的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)TNBC中EGFR蛋白表達(dá)水平因SGCE缺失下調(diào)（B），RNA測序結(jié)果顯示PI3K-AKT信號通路經(jīng)KEGG分析顯示顯著下調(diào)（C），p-AKT失活，其下游分子Bim表達(dá)上調(diào)（B），暗示PI3K-AKT信號通路參與SGCE調(diào)控。接下來進(jìn)一步確認(rèn)SGCE的作用是否由EGFR信號介導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)SGCE沉默后，EGFR過表達(dá)誘導(dǎo)乳腺癌干細(xì)胞、腫瘤微球以及克隆形成部分恢復(fù)（D-G）。作者探究了EGFR對ECM的影響，發(fā)現(xiàn)EGFR沉默后ECM相關(guān)基因表達(dá)量顯著下調(diào)，而EGFR在SGCE沉默的細(xì)胞中過表達(dá)可以使ECM基因表達(dá)量部分恢復(fù)（H-J）。以上結(jié)果表明SGCE通過EGFR調(diào)控BCSCs和ECM。

5.SGCE沉默誘導(dǎo)EGFR降解
    為了研究EGFR的動態(tài)變化，用EGF處理細(xì)胞發(fā)現(xiàn)EGFR在30min內(nèi)高表達(dá)（A）。相比之下，在EGF暴露于SGCE沉默細(xì)胞后，EGFR在同一時間點(diǎn)迅速下降(A,B)，這表明SGCE沉默會導(dǎo)致EGFR的降解。利用流式分析SGCE沉默時內(nèi)化的EGFR水平，發(fā)現(xiàn)EGFR內(nèi)化顯著促進(jìn)（C）。接下來研究了SGCE是如何影響EGFR內(nèi)化信號，通過阻斷內(nèi)吞作用（CME）和大胞飲作用的特異性抑制劑Pitstop和EIPA處理TNBC細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)部分恢復(fù)了因SGCE沉默引起的EGFR蛋白下降（D）。這些數(shù)據(jù)表明，SGCE沉默后通過CME和大胞飲作用途徑促進(jìn)EGFR的內(nèi)化和降解。利用NH4Cl處理細(xì)胞以抑制溶酶體活性，發(fā)現(xiàn)NH4Cl處理的SGCE沉默的細(xì)胞中EGFR蛋白表達(dá)水平被恢復(fù)（E,F）。作者對EGFR和溶酶體標(biāo)記物(LAMP1)共定位，發(fā)現(xiàn)EGFR在SGCE沉默細(xì)胞的溶酶體室優(yōu)先富集，且循環(huán)到細(xì)胞膜的數(shù)量顯著減少（G,H）。以上數(shù)據(jù)表明SGCE沉默增加了EGFR溶酶體降解，減少了EGFR循環(huán)到細(xì)胞膜。

6.SGCE沉默促進(jìn)EGFR與c-Cb1的相互作用
    作者建立SGCE與EGFR泛素化之間的調(diào)控關(guān)系，發(fā)現(xiàn)SGCE過表達(dá)抑制EGFR泛素化和k63連接泛素化，導(dǎo)致溶酶體降解(A)。這進(jìn)一步證實(shí)了SGCE沉默引起的EGFR降解是通過溶酶體降解介導(dǎo)的。進(jìn)一步研究了SGCE如何影響EGFR泛素化，發(fā)現(xiàn)SGCE沉默后EGFR與c-Cbl的結(jié)合明顯增強(qiáng)，但與Cbl-b或Cbl-c的結(jié)合沒有增強(qiáng)，而在正常的SGCE表達(dá)水平下，EGFR與c-Cbl的結(jié)合未被檢測到或很弱(B)，同時沉默SGCE和c-Cb1，EGFR降解消失（C），IP實(shí)驗(yàn)表明SGCE可以與c-Cb1結(jié)合(D)。以上結(jié)果表明SGCE沉默促進(jìn)EGFR與c-Cb1結(jié)合。

7.SGCE沉默對耐藥、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響
    作者進(jìn)一步探討了SGCE對EGFR TKI耐藥的作用，與親代細(xì)胞系相比，吉非替尼耐藥細(xì)胞系中SGCE的表達(dá)顯著上調(diào)，而SGCE沉默的癌細(xì)胞對吉非替尼治療敏感性增加，癌細(xì)胞耐藥最大IC50被大大降低（A-C）。此外，SGCE沉默顯著降低了TNBC細(xì)胞的遷移和侵襲能力（D-E），而將SGCE沉默的TNBC細(xì)胞與熒光素酶基因一起注入小鼠尾靜脈，與對照組相比，發(fā)現(xiàn)接受尾靜脈注射SGCE沉默細(xì)胞小鼠發(fā)生的肺轉(zhuǎn)移較少（F）。

8.機(jī)制

結(jié)論：
1. SGCE與腫瘤初發(fā)密切相關(guān)，通過EGFR調(diào)控BCSCs和ECM。
2. SGCE基因沉默增加了EGFR溶酶體降解，減少了EGFR循環(huán)到細(xì)胞膜，并促進(jìn)EGFR與c-Cb1結(jié)合。
3. SGCE沉默降低三陰性乳腺癌對EGFR抑制劑耐藥性，抑制其癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。
參考文獻(xiàn)：
Lina Zhao, Ting Qiu, Dewei Jiang, et al. SGCE Promotes Breast Cancer Stem Cells by Stabilizing EGFR. Advanced Science. 2020.