Trib1/Hoxa9/Erg軸在急性髓系白血病進(jìn)展中的作用

    急性髓系白血病（AML）是成年人最常見的急性白血病，目前治療仍以化療為主，但有70%左右獲得緩解的患者最終復(fù)發(fā)并演變?yōu)殡y治性白血病，導(dǎo)致治療失敗而死亡。轉(zhuǎn)錄調(diào)控異常是AML常見的分子特征。在AML中，造血轉(zhuǎn)錄因子常被認(rèn)定為癌基因或抑癌基因。Hox蛋白是關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，Hoxa9調(diào)控的轉(zhuǎn)錄程序參與AML的MLL融合、MOZ-TIF2、NUP98-NSD1、NPM1c或ASXL1融合/突變。這些突變上調(diào)了HOXA9的mRNA表達(dá)，并揭示了HOXA9過表達(dá)對(duì)小鼠造血細(xì)胞永生化的意義。然而，僅過表達(dá)Hoxa9并不足以發(fā)展成全面的AML，需要激活額外的輔助因子和/或合作通路。研究表明，多種信號(hào)通路與Hoxa9調(diào)控的轉(zhuǎn)錄程序相互作用，額外的分子機(jī)制可能影響Hoxa9驅(qū)動(dòng)的增強(qiáng)子修飾。最近，日本癌癥研究基金會(huì)的Takuro Nakamura教授及其團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)Trib1在髓系白血病發(fā)生中調(diào)控染色質(zhì)和Hoxa9驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的新機(jī)制，相關(guān)研究以“Trib1 promotes acute myeloid leukemia progression by modulating the transcriptional programs of Hoxa9”為題發(fā)表在Blood雜志上，雜志影響因子為17.543。
研究思路：

結(jié)果：
1.Trib1過表達(dá)對(duì)Hoxa9誘導(dǎo)髓系白血病生成的影響
    作者使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMYs-IRES-GFP將Hoxa9和/或Trib1導(dǎo)入Trib1敲除小鼠的骨髓細(xì)胞，建立了不朽的骨髓細(xì)胞系，表達(dá)（Trib1 hi）或不表達(dá)（Trib1 null）Trib1的Hoxa9細(xì)胞表現(xiàn)出未成熟的髓系形態(tài)（A）。兩種細(xì)胞類型Mac1和Gr1均呈陽性，而Trib1 hi細(xì)胞中Mac1和Gr1表達(dá)水平下降，CD34表達(dá)升高，提示Trib1 hi細(xì)胞較Trib1 null細(xì)胞具有更多未成熟特征（B）。Trib1 hi細(xì)胞中，C/EBPα p42而不是p30被發(fā)現(xiàn)顯著降低，ERK磷酸化增強(qiáng)，IL-3刺激后延長(zhǎng)（C，D），且與Trib1 null相比，Trib1 hi細(xì)胞也顯示出更高的增殖率和EdU摻入率，暗示Trib1誘導(dǎo)細(xì)胞周期的增加（E，F(xiàn)）?；蛭㈥嚵蟹治鯰rib1 hi/null細(xì)胞發(fā)現(xiàn)Trib1 hi特異性富集細(xì)胞周期以及C/EBP通路（G）。骨髓移植實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)只有Trib1 hi細(xì)胞才能在體內(nèi)誘導(dǎo)白血病發(fā)生（H）。這些結(jié)果表明Trib1過表達(dá)促進(jìn)了Hoxa9誘導(dǎo)的白血病發(fā)生。

2.AML中Hoxa9和C/EBPα的DNA結(jié)合特性
    Trib1 null和hi細(xì)胞中，Hoxa9的DNA結(jié)合峰的總體分布沒有顯著差異，其中39%和27%的DNA結(jié)合峰分別位于距離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS) 2 kb以內(nèi)(A)。MEME分析發(fā)現(xiàn)Hoxa9 (FLAG)和C/EBP結(jié)合峰顯示了Hoxa9，C/EBPα和Meis1顯著的濃度，暗示Hoxa9和C/EBP在染色質(zhì)水平上是接近的（B）。在Trib1缺失細(xì)胞中，Hoxa9和C/EBP的DNA結(jié)合出現(xiàn)了頻繁的關(guān)聯(lián)，且Hoxa9和C/EBP的結(jié)合峰有60.5%的重疊（C）。通過比較組蛋白H3K27ac和Hoxa9結(jié)合的分布。作者發(fā)現(xiàn)，在Trib1 null和hi細(xì)胞中，Hoxa9和H3K27ac峰經(jīng)常同時(shí)出現(xiàn)(D)，而在Trib1 null和hi細(xì)胞中，H3K27ac的整體沉積并沒有太大差異。在Trib1 hi和null細(xì)胞的啟動(dòng)子區(qū)、基因內(nèi)區(qū)和基因間區(qū)檢測(cè)到Hoxa9、C/EBP和H3K27ac的共沉積，此外，通過ChIP-seq檢測(cè)了C/EBP在Trib1 hi細(xì)胞中的DNA結(jié)合，發(fā)現(xiàn)由于p42的降解而富集了p30亞型，且41.1%的C/EBP結(jié)合位點(diǎn)在hi和null細(xì)胞之間重疊，暗示p30可能在hi細(xì)胞中發(fā)揮不同的作用（E）。

3.Trib1能夠調(diào)節(jié)Hoxa9誘導(dǎo)AML中的超級(jí)增強(qiáng)子
    作者比較了Trib1 null和hi細(xì)胞間的超級(jí)增強(qiáng)子譜，發(fā)現(xiàn)437個(gè)和765個(gè)超級(jí)增強(qiáng)子分別與Trib1 null和hi細(xì)胞中63.1%和46.2%的Hoxa9結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)（A）。通過對(duì)Trib1 hi或null特異性超級(jí)增強(qiáng)子的生物學(xué)過程通路的系統(tǒng)分析，我們確定了Trib1 hi細(xì)胞中的免疫系統(tǒng)、造血和骨髓細(xì)胞分化通路，提示Trib1 hi特異性超級(jí)增強(qiáng)子在造血系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用（B）。作者識(shí)別由Trib1和Hoxa9調(diào)控修飾超級(jí)增強(qiáng)子活性的重要靶點(diǎn)，選擇了61個(gè)Trib1 hi特異性超級(jí)增強(qiáng)子，其中8個(gè)基因在Trib1 hi細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并通過Trib1過表達(dá)鑒定為顯著修飾基因（C）。定量RT-PCR驗(yàn)證這8個(gè)基因的mRNA表達(dá)水平顯著升高（D）。ChIP-qPCR顯示，Trib1 hi細(xì)胞中Erg、Spns2、Rgl1和Pik3cd基因座的H3K27Ac沉積顯著增加（E），且在這些基因中，包括+85干細(xì)胞增強(qiáng)子在內(nèi)的Erg位點(diǎn)，可以觀察到Trib1 hi和null細(xì)胞之間H3K27Ac的顯著差異（F）。采用CRISPR/ cas9介導(dǎo)靶向Erg +85增強(qiáng)子，50 bp的純合缺失（包括增強(qiáng)子中一個(gè)假定的Hoxa9結(jié)合位點(diǎn)）消除了Erg的上調(diào)（G），表明Hoxa9在+85增強(qiáng)子上結(jié)合上調(diào)了Erg。

4.Trib1降解C/EBP對(duì)增強(qiáng)子和Hoxa9靶基因的作用
    在MEK1抑制劑U0126處理的Trib1 hi細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)超級(jí)增強(qiáng)子在Erg、Spns2和Pik3cd位點(diǎn)的H3K27Ac積累受到抑制（A），然而，mRNA表達(dá)的下調(diào)是邊際性的（B）。Trib1 null細(xì)胞的Cebpa沉默后， Erg、Spns2、Rgl1和Pik3cd超級(jí)增強(qiáng)子的H3K27Ac信號(hào)顯著增加（C），且這四個(gè)基因的表達(dá)顯著上調(diào)（D）。通過將編碼全長(zhǎng)(p42和p30)或N端截?cái)?僅p30)蛋白的人CEBPA cDNAs引入CEBPA沉默的Trib1 null細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)p42部分恢復(fù)了Erg mRNA和蛋白的表達(dá)以及組蛋白H3K27Ac的積累，而p30的表達(dá)沒有恢復(fù)（E）。綜上所述，Trib1對(duì)C/EBP p42的降解是某些Hoxa9結(jié)合位點(diǎn)上增強(qiáng)子修飾的主要驅(qū)動(dòng)力，而MEK/ERK的增強(qiáng)對(duì)這一事件略有貢獻(xiàn)。

5.Erg是Trib1作用于Hoxa9的重要靶點(diǎn)
    ChIP-seq分析顯示Trib1過表達(dá)上調(diào)了Erg水平，且Erg靶基因調(diào)控所需的Erg蛋白p55亞型的表達(dá)在Trib1 hi細(xì)胞中上調(diào)（A）。研究發(fā)現(xiàn)，與Trib1 hi細(xì)胞相比，表達(dá)Erg的Trib1 null細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)。相反，shRNA介導(dǎo)Erg沉默的Trib1 hi細(xì)胞顯示生長(zhǎng)抑制（C），而CRISPR/ cas9介導(dǎo)Erg沉默進(jìn)一步顯示Trib1 hi細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制等同于Trib1 null細(xì)胞（D）。此外，Erg缺失完全消除了體內(nèi)Trib1 hi細(xì)胞的白血病發(fā)展（E），盡管在Trib1 null細(xì)胞中Erg過表達(dá)不會(huì)發(fā)展為白血病，這表明在與Hoxa9表達(dá)相關(guān)的Trib1增強(qiáng)AML中，Erg上調(diào)是必需的，但不足以促進(jìn)體內(nèi)白血病的發(fā)生。

6.BRD4抑制劑抑制Hoxa9誘導(dǎo)的白血病生長(zhǎng)
    使用BRD4抑制劑JQ1處理Trib1 hi細(xì)胞, JQ1有效地以Trib1依賴的方式抑制白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)(A), 并抑制Trib1/Hoxa9靶向Erg和Spns2的表達(dá)，而不是Trib1 hi細(xì)胞中Rgl1和Pik3cd的表達(dá)(B)，且JQ1能誘導(dǎo)Trib1 hi細(xì)胞的單核細(xì)胞分化和早期凋亡（C，D）。作者又檢測(cè)了CDK7/8抑制劑THZ1作為超級(jí)增強(qiáng)子靶向藥物的作用，與JQ1相比，THZ1只表現(xiàn)出溫和的抗增殖作用，而沒有觀察到Erg和Spns2的下調(diào)（E，F(xiàn)）。骨髓移植Trib1 hi細(xì)胞后，一周后給小鼠注射JQ1，無論是否使用柔紅霉素和阿糖胞苷治療，JQ1治療都能顯著提高白血病小鼠的存活率（G）?？偟膩碚f，這些結(jié)果突出了靶向Trib1修飾的Erg超級(jí)增強(qiáng)子的重要性。

7.TRIB1-ERG軸在AML細(xì)胞中的參與
    通過分析TRIB1和HOXA9在人AML細(xì)胞系中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在KU812和P39細(xì)胞株中，TRIB1和HOXA9表達(dá)水平較高，HL-60細(xì)胞ERG低表達(dá)提示HOXA9對(duì)ERG表達(dá)的調(diào)控機(jī)制可能不同（A）。shRNA介導(dǎo)的TRIB1缺失發(fā)現(xiàn)KU812細(xì)胞中ERG和SPNS2的下調(diào)（B），KU812細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制（C）。利用250 nM的JQ1處理KU812和P39細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其對(duì)KU812和P39細(xì)胞均有生長(zhǎng)抑制作用，并抑制了兩株細(xì)胞的ERG表達(dá)（D，E）。這些結(jié)果表明，Trib1介導(dǎo)的ERG上調(diào)在人類AML白血病細(xì)胞生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用。通過預(yù)后掃描在線平臺(tái)重新評(píng)估了ERG和SPNS2上調(diào)在人類AML中的可能作用，發(fā)現(xiàn)ERG或SPNS2的表達(dá)水平與正常核型AML的不良預(yù)后顯著相關(guān)（F）?？偟膩碚f，我們的結(jié)果表明ERG是Hoxa9和C/EBP的一個(gè)重要靶點(diǎn)，并且可以被Trib1調(diào)控。

小結(jié)：
1．Trib1通過降解C/EBP和修飾與Hoxa9相關(guān)的超級(jí)增強(qiáng)子來影響Hoxa9在髓系白血病發(fā)生中的作用。
2. Erg是Trib1和Hoxa9的關(guān)鍵靶點(diǎn)，對(duì)BRD4抑制反應(yīng)迅速，在白血病發(fā)生中起關(guān)鍵作用。
參考文獻(xiàn)：
Seiko Yoshino, Takashi Yokoyama, Yoshitaka Sunami, et al. Trib1 promotes acute myeloid leukemia progression by modulating the transcriptional programs of Hoxa9. Blood. 2020.