單細胞測序和TCGA數據庫聯(lián)合分析助力乳腺癌高分文章發(fā)表

    乳腺癌（BC）是全世界最常見的癌癥，是女性中最主要的癌癥。三陰性乳腺癌（TNBC）是惡性程度高、易轉移、高復發(fā)和預后差的一類乳腺癌，占所有乳腺癌病例的15%。由于缺少雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮生長因子受體2（HER2）的表達，TNBC主要治療方式為手術，放化療，佐以PDL1抑制劑和PARP抑制劑等治療方式?；熕幬锬軌驓⑺勒诜至训哪[瘤細胞，卻不能有效作用于乳腺癌干細胞（BCSCs），而BCSCs富集使TNBC對藥物具有耐藥性。目前，腫瘤干細胞介導的耐藥性是TNBC治療的研究難點之一。最近，中國科學院昆明動物研究所的陳策實教授及其團隊通過單細胞測序數據庫和TCGA數據庫聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)SGCE在乳腺癌干細胞中具有重要作用，并對SGCE在乳腺癌干細胞特性維持的調控機制進行研究，相關研究結果以“SGCE Promotes Breast Cancer Stem Cells by Stabilizing EGFR”為題發(fā)表在Advanced science雜志上，雜志影響因子為15.84。
研究思路：

結果：
1.SGCE基因在乳腺癌中的表達特征
    作者通過github網站上的TNBC單細胞測序結果以及TCGA數據庫分析發(fā)現(xiàn)SGCE與BCSC增殖相關（A-C），且研究發(fā)現(xiàn)SGCE mRNA和蛋白在CD24lowCD44high細胞中高表達（D-E）。作者進一步研究了SGCE在BCSCs中的功能，通過流式細胞分析發(fā)現(xiàn)TNBC細胞中，SGCE沉默導致CD24lowCD44high細胞和ALDH+細胞比例降低（F-H），同時顯著減少了腫瘤微球數量和克隆形成能力（I-L）。體外實驗表明SGCE沉默嚴重降低了腫瘤生成能力（M）。綜上所述， SGCE在體內和體外與腫瘤發(fā)生密切相關。

2.SGCE與藥物抗性的相關性
    SGCE可以影響乳腺癌干細胞特性，而腫瘤干細胞與耐藥相關，接下來研究了SGCE在化療敏感性中的作用。從化療患者的生存圖可以看出，SGCE表達水平較低的患者預后較好(A)。細胞活力檢測表明SGCE沉默的TNBC細胞對化療藥物產生較低的細胞活性劑量（B）。接下來通過腫瘤微球培養(yǎng)和克隆形成試驗研究了在使用阿霉素、順鉑和紫杉醇治療后的干細胞樣活性。藥物治療顯著增加了腫瘤微球和克隆形成數量，暗示化療顯著富集了乳腺癌干細胞，在SGCE沉默后富集顯著減少，且SGCE沉默減弱藥物治療抗性（C-J）。體外實驗發(fā)現(xiàn)SGCE沉默不能誘導腫瘤體積的顯著性下降，而在阿霉素治療后能顯著抑制腫瘤生長，腫瘤中CD24lowCD44high細胞比例顯著下降（K-L），表明SGCE低表達促進化療療效提高。

3.SGCE與CAF、ECM相關性
    TCGA數據顯示ECM受體相互作用途徑與SGCE表達顯著相關，而SGCE沉默乳腺癌細胞系的測序結果顯示ECM受體相互作用途徑富集被減弱（A-B）。通過馬尾松三色染色檢測膠原蛋白，發(fā)現(xiàn)SGCE沉默異種移植瘤組織中膠原蛋白表達水平顯著減少，而其他ECM成分，包括纖連蛋白、 CD44也顯著減少（C）。RT-PCR顯示了ECM受體基因表達量顯著降低（D）。進一步研究發(fā)現(xiàn)SGCE沉默后細胞中基質與膠原的黏附明顯減少，暗示ECM與其受體之間的相互作用消失（E-F）。作者從患者乳腺腫瘤中提取的成纖維細胞（CAF）與SGCE沉默的TNBC細胞共培養(yǎng)時，CAF表現(xiàn)出較低的ECM表達和較低的硬度，且CAF表現(xiàn)出較弱的遷移能力（G-I）。為了觀察癌細胞在體內招募CAFs的能力，檢測了SGCE沉默的腫瘤中的CAF標記物，發(fā)現(xiàn)CAF細胞標志分子（ACTA2、S100A4、S100A2）在癌組織中表達量顯著性下降（J-K）。

4.SGCE通過EGFR調控BCSCs和ECM
    為了探討SGCE如何維持BCSCs干細胞特性，作者分析了 SGCE與其他參與干細胞特性維持的蛋白之間的表達相關性，發(fā)現(xiàn)EGFR表達水平與SGCE水平呈正相關（A）。接下來進一步檢測了SGCE是否影響了EGFR的表達水平，發(fā)現(xiàn)TNBC中EGFR蛋白表達水平因SGCE缺失下調（B），RNA測序結果顯示PI3K-AKT信號通路經KEGG分析顯示顯著下調（C），p-AKT失活，其下游分子Bim表達上調（B），暗示PI3K-AKT信號通路參與SGCE調控。接下來進一步確認SGCE的作用是否由EGFR信號介導，發(fā)現(xiàn)SGCE沉默后，EGFR過表達誘導乳腺癌干細胞、腫瘤微球以及克隆形成部分恢復（D-G）。作者探究了EGFR對ECM的影響，發(fā)現(xiàn)EGFR沉默后ECM相關基因表達量顯著下調，而EGFR在SGCE沉默的細胞中過表達可以使ECM基因表達量部分恢復（H-J）。以上結果表明SGCE通過EGFR調控BCSCs和ECM。

5.SGCE沉默誘導EGFR降解
    為了研究EGFR的動態(tài)變化，用EGF處理細胞發(fā)現(xiàn)EGFR在30min內高表達（A）。相比之下，在EGF暴露于SGCE沉默細胞后，EGFR在同一時間點迅速下降(A,B)，這表明SGCE沉默會導致EGFR的降解。利用流式分析SGCE沉默時內化的EGFR水平，發(fā)現(xiàn)EGFR內化顯著促進（C）。接下來研究了SGCE是如何影響EGFR內化信號，通過阻斷內吞作用（CME）和大胞飲作用的特異性抑制劑Pitstop和EIPA處理TNBC細胞，發(fā)現(xiàn)部分恢復了因SGCE沉默引起的EGFR蛋白下降（D）。這些數據表明，SGCE沉默后通過CME和大胞飲作用途徑促進EGFR的內化和降解。利用NH4Cl處理細胞以抑制溶酶體活性，發(fā)現(xiàn)NH4Cl處理的SGCE沉默的細胞中EGFR蛋白表達水平被恢復（E,F）。作者對EGFR和溶酶體標記物(LAMP1)共定位，發(fā)現(xiàn)EGFR在SGCE沉默細胞的溶酶體室優(yōu)先富集，且循環(huán)到細胞膜的數量顯著減少（G,H）。以上數據表明SGCE沉默增加了EGFR溶酶體降解，減少了EGFR循環(huán)到細胞膜。

6.SGCE沉默促進EGFR與c-Cb1的相互作用
    作者建立SGCE與EGFR泛素化之間的調控關系，發(fā)現(xiàn)SGCE過表達抑制EGFR泛素化和k63連接泛素化，導致溶酶體降解(A)。這進一步證實了SGCE沉默引起的EGFR降解是通過溶酶體降解介導的。進一步研究了SGCE如何影響EGFR泛素化，發(fā)現(xiàn)SGCE沉默后EGFR與c-Cbl的結合明顯增強，但與Cbl-b或Cbl-c的結合沒有增強，而在正常的SGCE表達水平下，EGFR與c-Cbl的結合未被檢測到或很弱(B)，同時沉默SGCE和c-Cb1，EGFR降解消失（C），IP實驗表明SGCE可以與c-Cb1結合(D)。以上結果表明SGCE沉默促進EGFR與c-Cb1結合。

7.SGCE沉默對耐藥、侵襲和轉移的影響
    作者進一步探討了SGCE對EGFR TKI耐藥的作用，與親代細胞系相比，吉非替尼耐藥細胞系中SGCE的表達顯著上調，而SGCE沉默的癌細胞對吉非替尼治療敏感性增加，癌細胞耐藥最大IC50被大大降低（A-C）。此外，SGCE沉默顯著降低了TNBC細胞的遷移和侵襲能力（D-E），而將SGCE沉默的TNBC細胞與熒光素酶基因一起注入小鼠尾靜脈，與對照組相比，發(fā)現(xiàn)接受尾靜脈注射SGCE沉默細胞小鼠發(fā)生的肺轉移較少（F）。

8.機制

結論：
1. SGCE與腫瘤初發(fā)密切相關，通過EGFR調控BCSCs和ECM。
2. SGCE基因沉默增加了EGFR溶酶體降解，減少了EGFR循環(huán)到細胞膜，并促進EGFR與c-Cb1結合。
3. SGCE沉默降低三陰性乳腺癌對EGFR抑制劑耐藥性，抑制其癌細胞的侵襲和轉移。
參考文獻：
Lina Zhao, Ting Qiu, Dewei Jiang, et al. SGCE Promotes Breast Cancer Stem Cells by Stabilizing EGFR. Advanced Science. 2020.