LINC00941促進(jìn)大腸癌轉(zhuǎn)移

    LINC00941是一種新的lncRNA，在腫瘤發(fā)生過程中表現(xiàn)出原發(fā)性和促轉(zhuǎn)移行為。然而，其在轉(zhuǎn)移性大腸癌中的作用仍不清楚。因此，小編給大家介紹發(fā)表于影響因子為10.717的“Cell Death & Differentiation”的文章“LINC00941 promotes CRC metastasis through preventing SMAD4 protein degradation and activating the TGF-β/SMAD2/3 signaling pathway”，旨在探討LINC00941在大腸癌轉(zhuǎn)移中的作用及其機(jī)制。

    在本文中，大腸癌中LINC00941表達(dá)上調(diào)，且上調(diào)LINC00941與預(yù)后不良有關(guān)。在功能上，LINC00941促進(jìn)裸鼠的遷移和侵襲能力，加速肺轉(zhuǎn)移。在機(jī)制上，LINC00941激活了大腸癌細(xì)胞中的EMT。LINC00941通過直接結(jié)合SMAD4蛋白MH2結(jié)構(gòu)域并與β-TrCP競爭以阻止SMAD4蛋白降解激活TGF-β/SMAD2/3信號通路，從而激活EMT。
技術(shù)路線：

結(jié)果：
1.LINC00941表達(dá)上調(diào)與大腸癌預(yù)后不良有關(guān)
    組織微陣列證實LINC00941在大腸癌組織中的擴(kuò)增表達(dá)，LINC00941主要定位于細(xì)胞質(zhì)（圖1a），在大腸癌組織中表達(dá)上調(diào)（圖1b）。Kaplan-Meier生存率和Cox比例風(fēng)險分析表明，與低LINC00941表達(dá)水平的CRC患者相比，具有較高LINC00941表達(dá)水平的CRC患者的總生存時間（OS）顯著縮短，表明較高的LINC00941水平是結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險因素（圖1c）。利用TCGA，我們發(fā)現(xiàn)LINC00941是一種轉(zhuǎn)移和生存相關(guān)的lncRNA，與癌旁非腫瘤組織相比（圖1d）在大腸癌組織中上調(diào)，并且與大腸癌患者的OS時間相關(guān)（圖1e）。ISH染色進(jìn)一步證實，LINC00941在腫瘤組織中的表達(dá)顯著增高，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)最高（圖1f，g）。我們還比較了LINC00941在大腸癌細(xì)胞系（HT-29、HCT-116、SW480、SW620和LoVo細(xì)胞）和永生化正常結(jié)腸上皮細(xì)胞（FHC細(xì)胞）中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)LINC00941在所有研究的大腸癌細(xì)胞系中高表達(dá)，尤其是在高侵襲性大腸癌細(xì)胞系（SW620和LoVo）中與FHC細(xì)胞相比過表達(dá)，提示LINC00941在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中起著致癌作用（圖1h）。

2.LINC00941促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，并激活EMT
    為了闡明LINC00941在大腸癌中的生物學(xué)意義，我們分別用攜帶LINC00941 cDNA或sh-LINC00941的慢病毒載體在HCT-116和LoVo細(xì)胞中過表達(dá)或沉默LINC00941。與對照組相比，HCT-116細(xì)胞中LINC00941的過表達(dá)顯著增加了細(xì)胞的侵襲和遷移能力，而LoVo細(xì)胞中LINC00941的下調(diào)對細(xì)胞的侵襲和遷移能力有相反的影響（圖2a，b）。用sh-LINC00941轉(zhuǎn)染的LoVo細(xì)胞處理的裸鼠產(chǎn)生的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)較少，而用LINC00941過表達(dá)的HCT-116細(xì)胞處理的裸鼠比相應(yīng)的對照組產(chǎn)生更多的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)（圖2c，d）。此外，與對照組相比，接受HCT-116-LINC00941細(xì)胞的裸鼠的OS較短，而接受LoVo-ShLINC00941細(xì)胞的裸鼠OS更長（圖2e）。這些數(shù)據(jù)表明LINC00941對CRC進(jìn)展有促進(jìn)作用。此外，LoVo Sh-LINC00941細(xì)胞表達(dá)下調(diào)，呈現(xiàn)出更多的上皮形態(tài)，而HCT-116-LINC00941細(xì)胞與相應(yīng)對照組相比呈現(xiàn)出更多的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)（圖2f，g），這表明LINC00941可能通過激活EMT促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移。HCT-116-LINC00941顯示ZO-1和E-cadherin的mRNA和蛋白質(zhì)水平降低，但波形蛋白、纖維連接蛋白和Twist1的mRNA和蛋白質(zhì)水平增加（圖2h，i）。相反，LoVo Sh-LINC00941細(xì)胞顯示ZO-1和Ecadherin的mRNA和蛋白質(zhì)水平增加，但波形蛋白、纖維連接蛋白和Twist1的mRNA和蛋白質(zhì)水平降低（圖2h，i），進(jìn)一步證實LINC00941至少部分通過調(diào)節(jié)EMT促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移。

3.LINC00941通過抑制SMAD4泛素化增強(qiáng)其穩(wěn)定性
    LncRNAs通常通過RNA-蛋白相互作用影響基因表達(dá)。因此，我們進(jìn)一步研究了可能與LINC00941相互作用的蛋白，以獲得關(guān)于LINC00941誘導(dǎo)的EMT在CRC轉(zhuǎn)移中的深入機(jī)制觀點(diǎn)。RNA下拉分析表明SMAD4可以特異性結(jié)合LINC00941（圖3a）。同時，SMAD4在LoVo Sh-LINC00941細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，在HCT-116-LINC00941細(xì)胞中上調(diào)（圖3b）。一致地，SMAD4富集于生物素標(biāo)記的LINC00941組中（圖3c）。此外，通過瓊脂糖凝膠電泳和RIP分析進(jìn)一步驗證了LINC00941和SMAD4之間的相互作用（圖3d，e）。為了確定LINC00941和SMAD4的確切結(jié)合區(qū)域，我們構(gòu)造了一系列截斷的LINC00941和SMAD4結(jié)構(gòu)。LINC00941的1465到1895核苷酸可以結(jié)合SMAD4，而SMAD4的MH2結(jié)構(gòu)域和全長SMAD4可以結(jié)合LINC00941（圖3f，g），表明LINC00941是SMAD4的結(jié)合伙伴。細(xì)胞質(zhì)lncRNAs通常負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)修飾的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。LINC00941抑制導(dǎo)致SMAD4蛋白表達(dá)減少，而LINC00941過表達(dá)上調(diào)SMAD4（圖3b）。此外，如LINC00941通過延長其降解半衰期來增強(qiáng)SMAD4蛋白的穩(wěn)定性（圖3h，i），這意味著LINC00941可以通過其蛋白質(zhì)降解來調(diào)節(jié)SMAD4。由于SMAD4蛋白降解是通過泛素-蛋白酶體途徑介導(dǎo)的，為了深入了解LINC00941誘導(dǎo)SMAD4降解的機(jī)制，我們用蛋白酶體抑制劑（MG132）處理LoVo-Sh-LINC00941細(xì)胞。通過Western blot分析確定，MG132顯著恢復(fù)了LoVo-Sh-LINC00941細(xì)胞中的SMAD4蛋白水平（圖3j），表明泛素蛋白酶體途徑參與了LINC00941誘導(dǎo)的SMAD4降解。為了進(jìn)一步驗證這一發(fā)現(xiàn)，我們評估了LINC00941過表達(dá)和LINC00941沉默的CRC細(xì)胞中SMAD4的多泛素化。如預(yù)期，當(dāng)LINC00941過表達(dá)時，SMAD4泛素化顯著降低，而當(dāng)LINC00941被沉默時，SMAD4泛素化顯著增加（圖3k，l）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明LINC00941可以通過抑制SMAD4在CRC中的泛素化而穩(wěn)定SMAD4。

4.LINC00941通過與β-TrCP競爭抑制SMAD4泛素化
    鑒于SMAD4可被β-TrCP多泛素化和降解，我們評估了β-TrCP在大腸癌SMAD4泛素化和降解中的功能意義。在LoVo和HCT-116細(xì)胞中抑制β-TrCP的表達(dá)可以顯著提高SMAD4蛋白的表達(dá)水平（圖4a）。同樣，在抑制了LoVo和HCT-116細(xì)胞中β-TrCP的表達(dá)后，通過免疫沉淀發(fā)現(xiàn)SMAD4蛋白泛素化水平顯著降低（圖4b）。接下來，我們發(fā)現(xiàn)缺少LINC00941顯著增加了SMAD4和β-TrCP的結(jié)合（圖4c）。相反，過表達(dá)LINC00941可以顯著提高抑制SMAD4和β-TrCP的結(jié)合（圖4d）。此外，我們進(jìn)一步確定SMAD4和FL-SMAD4的MH2結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合β-TrCP（圖4e），表明β-TrCP通過結(jié)合SMAD4和FL-SMAD4的MH2結(jié)構(gòu)域來控制SMAD4的泛素化和降解?？紤]到SMAD4和FL-SMAD4的MH2結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合LINC00941，我們假設(shè)LINC00941通過與β-TrCP競爭來抑制SMAD4泛素化。正如預(yù)期的那樣，競爭性RNA下拉分析進(jìn)一步證實了LINC00941和β-TrCP之間的競爭（圖4e）?？傊@些數(shù)據(jù)證實了LINC00941可以通過與β-TrCP競爭來提高SMAD4蛋白的穩(wěn)定性，從而防止SMAD4降解。

5.在轉(zhuǎn)移性大腸癌中，TGF-β1上調(diào)LINC00941，并與SMAD2/3信號通路的激活有關(guān)
    TGF-β1/SMAD信號通路是EMT的一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，SMAD4是一個重要的輔因子。鑒于LINC00941對SMAD4的穩(wěn)定性很重要，并且LINC00941包含預(yù)測的TGF-β1靶點(diǎn)，我們評估了LINC00941在TGF-β1/SMAD信號通路中的作用。結(jié)果表明，當(dāng)用TGF-β1處理LINC00941沉默的細(xì)胞時，LINC00941水平顯著升高，而當(dāng)LINC00941過表達(dá)的細(xì)胞受到TGF-β1抑制劑disitertide的作用時，內(nèi)源性LINC00941水平顯著降低（圖5a，b）。一致地，與對照組相比，TGF-β1處理增加了LINC00941沉默的細(xì)胞的侵襲和遷移能力，而TGF-β1受體的抑制減輕了LINC00941過表達(dá)細(xì)胞的侵襲和遷移能力（圖5c，d）。此外，與對照組相比，用disitertide處理過表達(dá)的LINC00941細(xì)胞顯示ZO-1和Ecadherin的mRNA和蛋白質(zhì)水平增加（圖5e，f）。相比之下，LINC00941沉默的細(xì)胞顯示ZO-1和E-cadherin的mRNA和蛋白質(zhì)水平降低，但波形蛋白、纖維連接蛋白和Twist1的mRNA和蛋白質(zhì)水平增加（圖5e，f），進(jìn)一步證實TGF-β1參與了LINC00941誘導(dǎo)的EMT。更重要的是，熒光素酶報告分析顯示，熒光素酶活性在使用TGF-β1處理后顯著增加（圖5g）。用LoVo Sh-LINC00941細(xì)胞和TGF-β處理的裸鼠產(chǎn)生更多的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，而HCT-116-LINC00941細(xì)胞和disitertide處理的裸鼠比相應(yīng)的對照組產(chǎn)生更少的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)（圖5h，i）。此外，與對照組相比，用LoVo Sh-LINC00941細(xì)胞和TGF-β處理的裸鼠的OS較短，HCT-116-LINC00941細(xì)胞和disitertide處理的裸鼠的OS較對照組長（圖5j）。這些數(shù)據(jù)證實了TGF-β1與LINC00941有很強(qiáng)的相互作用。

結(jié)論：
    我們的研究證實，LINC00941通過阻止SMAD4蛋白降解激活TGF-β/SMAD2/3信號通路促進(jìn)大腸癌的轉(zhuǎn)移，為進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)移性大腸癌的機(jī)制和新的潛在治療靶點(diǎn)提供了新的視角。