TCGA+TIMER幫你寫出腫瘤免疫好文章

    乳腺癌患者的預(yù)后與免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)和lncRNA的表達(dá)密切相關(guān)。東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理與病理生理學(xué)系，Shen Yong等人2020年5月發(fā)表在Genomics的一篇文章“Identification and validation of immune-related lncRNA prognostic signature for breast cancer” 影響因子：6.205。 該文通過(guò)將ssGSEA應(yīng)用于這些樣品的轉(zhuǎn)錄組，評(píng)估了從TCGA (https://portal.gdc.cancer.gov)獲得的1109個(gè)乳腺癌樣品中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而產(chǎn)生了高免疫細(xì)胞浸潤(rùn)組和低免疫細(xì)胞浸潤(rùn)組。為了探討預(yù)后簽名在臨床應(yīng)用中的可行性，作者使用單變量和多變量COX分析以及將乳腺癌的預(yù)后標(biāo)志與乳腺癌患者的臨床指標(biāo)（例如性別，年齡，病理分期等）進(jìn)行了比較。 ROC分析，并確認(rèn)11個(gè)lncRNA預(yù)后標(biāo)志物可能是乳腺癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，這11個(gè)lncRNA對(duì)乳腺癌的預(yù)后特征與免疫細(xì)胞亞型的浸潤(rùn)有關(guān)。

結(jié)果:
1. 乳腺癌分組的構(gòu)建和驗(yàn)證
    作者從TCGA獲得了1109個(gè)乳腺癌樣品和113個(gè)癌旁樣品。將ssGSEA方法應(yīng)用于乳腺癌樣品的轉(zhuǎn)錄組，以評(píng)估免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)。包括二十四個(gè)與免疫相關(guān)的術(shù)語(yǔ)，以消除乳腺癌中多種免疫細(xì)胞類型的豐富性。通過(guò)使用無(wú)監(jiān)督分層聚類算法，根據(jù)免疫浸潤(rùn)將乳腺癌樣本分為兩組，包括高免疫細(xì)胞浸潤(rùn)組（n = 943）和低免疫細(xì)胞浸潤(rùn)組（n = 166）（圖1a）。為了驗(yàn)證上述分組策略的可行性，基于乳腺癌的表達(dá)譜，使用ESTIMATE算法來(lái)計(jì)算腫瘤純度，ESTIMATE評(píng)分，免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分。與低免疫細(xì)胞浸潤(rùn)組相比，高免疫細(xì)胞浸潤(rùn)組的腫瘤純度較低，但估計(jì)得分，免疫得分和基質(zhì)分?jǐn)?shù)更高。高免疫細(xì)胞浸潤(rùn)組（Immunity-H）與ESTIMATE評(píng)分，免疫評(píng)分和基質(zhì)基質(zhì)分?jǐn)?shù)（Strromal Score）呈顯著正相關(guān)，而低免疫細(xì)胞浸潤(rùn)組（Immunity-H）與陽(yáng)性免疫組之間呈顯著正相關(guān)）和腫瘤純度（圖1b）。與低免疫細(xì)胞浸潤(rùn)組相比，高免疫細(xì)胞浸潤(rùn)組具有更高的免疫成分和更低的腫瘤純度（p <.05）。此外，作者發(fā)現(xiàn)高免疫細(xì)胞浸潤(rùn)組中HLA家族和CD274（PD-L1）的表達(dá)分別顯著高于低免疫細(xì)胞浸潤(rùn)組中的表達(dá)（p <0.01）（圖1c和d）。此外，作者使用CIBERSORT方法驗(yàn)證了上述各組，發(fā)現(xiàn)高免疫細(xì)胞浸潤(rùn)組的免疫細(xì)胞種類更多（圖1e）。總的來(lái)說(shuō)，該乳腺癌分組可用于隨訪分析。

圖1.乳腺癌分組的構(gòu)建和驗(yàn)證

2. 腫瘤組與癌旁組織，高免疫細(xì)胞浸潤(rùn)組與低免疫細(xì)胞浸潤(rùn)組之間lncRNA差異表達(dá)的分析
    根據(jù)| log2FC |> 1，F(xiàn)DR <0.05的標(biāo)準(zhǔn)，作者分析了乳腺癌組（1109例）和乳腺癌癌旁組（113例）之間的差異，發(fā)現(xiàn)了2999個(gè)差異表達(dá)的lncRNA，其中2208和791分別被上調(diào)和下調(diào)（圖2a）。根據(jù)相同的標(biāo)準(zhǔn)，與低免疫細(xì)胞浸潤(rùn)組相比，高免疫細(xì)胞浸潤(rùn)組中鑒定了1422個(gè)差異表達(dá)的lncRNA，其中455個(gè)上調(diào)而967個(gè)下調(diào)（圖2b）。經(jīng)過(guò)雙向Venn分析，與癌旁癌和低免疫細(xì)胞浸潤(rùn)組相比，在腫瘤組和高免疫細(xì)胞浸潤(rùn)組中共檢測(cè)到696個(gè)差異表達(dá)的lncRNA（圖2c）?？傊@些結(jié)果表明在乳腺癌組織中存在與免疫相關(guān)的lncRNA。

圖2.差異表達(dá)lncRNA的分析

3. 乳腺癌11種與免疫相關(guān)的lncRNA預(yù)后標(biāo)志的鑒定和評(píng)估
    基于乳腺癌樣本的生存數(shù)據(jù)集，作者將對(duì)696個(gè)lncRNA的表達(dá)譜應(yīng)用單變量Cox回歸。按照p <0.001的標(biāo)準(zhǔn)，總共確定了18個(gè)差異表達(dá)的lncRNA（圖3a）。為了避免過(guò)度擬合預(yù)后標(biāo)志，作者對(duì)這些lncRNA進(jìn)行了Lasso回歸分析，發(fā)現(xiàn)了17個(gè)差異表達(dá)的lncRNA與乳腺癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)（圖3b），通過(guò)10輪全面交叉驗(yàn)證確定懲罰參數(shù)的最佳值（圖3c）。通過(guò)逐步多重Cox回歸分析，得到11種lncRNA，包括LINC00668，LINC02418，AL356515.1，LINC01010，AP005131.6，AL772337.1，AC027514.1，AL161646.2，AC004847.1，AC243773.2和AL591686.1。從以上17種lncRNA中進(jìn)一步鑒定（表1）。然后根據(jù)這11個(gè)lncRNA的表達(dá)水平計(jì)算每個(gè)樣品的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分= 0.06 * LINC00668 + 0.13 * LINC02418 + 0.24 * AL356515.1–0.23 * LINC01010–0.15 * AP005131.6 + 0.18 * AL772337.1 + 0.21 * AC0-27514.1 + 0.17 * AL161646.2–0.13 * AC004847.1 + 0.07 * AC243773.2–0.13 * AL591686.1。根據(jù)中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，將乳腺癌樣本分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。 Kaplan-Meier曲線顯示，高風(fēng)險(xiǎn)組的樣本表現(xiàn)出比低風(fēng)險(xiǎn)組更差的總生存（OS），表明風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的預(yù)后特征是有效的（圖3d）。生成風(fēng)險(xiǎn)曲線和散點(diǎn)圖以顯示每個(gè)乳腺癌樣本的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和生存狀態(tài)。高風(fēng)險(xiǎn)組樣本的風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)和死亡率高于低風(fēng)險(xiǎn)組（圖3e和f）。在乳腺癌樣品中這11個(gè)lncRNA表達(dá)譜的熱圖顯示，在低風(fēng)險(xiǎn)組中LINC01010，AP005131.6，AC004847.1和AL591686.1高表達(dá)，而LINC00668，LINC02418，AL356515.1，AC027514.1 ，AL772337.1，AL161646.2和AC243773.2在高風(fēng)險(xiǎn)組中高表達(dá)（圖3g）。這些研究共同確定了11種與免疫相關(guān)的lncRNA作為乳腺癌的預(yù)后標(biāo)志。

圖3.乳腺癌免疫相關(guān)lncRNA預(yù)后標(biāo)志的鑒定和評(píng)估

4. 評(píng)估11種與免疫相關(guān)的lncRNAs作為乳腺癌患者獨(dú)立預(yù)后因素的評(píng)估
    單因素和多因素Cox回歸分析用于探討上述11種免疫相關(guān)的lncRNA是否是乳腺癌的預(yù)后因素，而與臨床病理因素（例如年齡，性別和病理階段）無(wú)關(guān)。單變量Cox回歸分析的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和95％CI的風(fēng)險(xiǎn)比（HR）分別為1.328和1.256–1.404（p <0.001），多變量Cox回歸分析的風(fēng)險(xiǎn)比（p <0.001），表明11個(gè)lncRNA是乳腺癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素（圖4a和b）。為了比較風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分對(duì)乳腺癌患者預(yù)后的敏感性和特異性，進(jìn)行了時(shí)間依賴性受體工作特征（ROC）分析。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的ROC曲線下面積（AUC）為0.836（圖4c），表明11種lncRNA對(duì)乳腺癌的預(yù)后特征是高度可靠的?？偟膩?lái)說(shuō)，11種免疫相關(guān)的lncRNA是乳腺癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。

圖4. Cox回歸分析用于評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的獨(dú)立預(yù)后價(jià)值

5 乳腺癌的11種與免疫相關(guān)的lncRNA預(yù)后信號(hào)與免疫細(xì)胞亞型浸潤(rùn)的相關(guān)性
    鑒于這11種lncRNA與腫瘤免疫力相關(guān)，作者接下來(lái)使用TIMER數(shù)據(jù)庫(kù) (https://cistrome.shinyapps.io/timer/)中的數(shù)據(jù)分析了11種lncRNA預(yù)后標(biāo)記與乳腺癌免疫細(xì)胞亞型浸潤(rùn)之間的相關(guān)性。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分為B細(xì)胞，CD4 + T細(xì)胞，CD8 + T細(xì)胞，DC，嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的相關(guān)值為-0.111，-0.205，-0.169，-0.208，-0.204和-0.097，分別表明這些免疫細(xì)胞亞型的浸潤(rùn)與乳腺癌的預(yù)后顯著負(fù)相關(guān)（圖5a-f）。綜上所述，乳腺癌的11種lncRNA預(yù)后標(biāo)志與這些免疫細(xì)胞亞型的浸潤(rùn)有關(guān)。

圖5.乳腺癌的11種lncRNA預(yù)后特征與免疫細(xì)胞亞型浸潤(rùn)之間的相關(guān)性

    風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)ssGSEA評(píng)分的六個(gè)最顯著相關(guān)性。 a. B細(xì)胞。 b. CD4 + T細(xì)胞。 c. CD8 + T細(xì)胞。 d. 樹(shù)突狀。 e. 中性粒細(xì)胞。 f. 巨噬細(xì)胞。
結(jié)論：
    總之，這些研究確定了11種lncRNA作為乳腺癌的預(yù)后標(biāo)志。乳腺癌的11種lncRNA預(yù)后特征與免疫細(xì)胞亞型的浸潤(rùn)有關(guān)。
參考文獻(xiàn)：
Shen Yong, Peng Xiaowei, Shen Chuanlu, Identification and validation of immune-related lncRNA prognostic signature for breast cancer.[J] .Genomics, 2020, 112: 2640-2646.