單細(xì)胞測(cè)序揭示小鼠衰老細(xì)胞圖譜

    衰老是時(shí)間賜予所有生物不可拒絕的禮物，但是這個(gè)過(guò)程是如何完成的卻一直困擾著科學(xué)家們。本文使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?yàn)樗ダ系牡絹?lái)提供了見(jiàn)解，并于2020年6月15日發(fā)表于《Nature》。
    衰老過(guò)程中細(xì)胞會(huì)逐漸喪失生理完整性，導(dǎo)致功能受損和死亡易感性增加。為了更好地了解這些過(guò)程，作者構(gòu)建了小家鼠整個(gè)壽命期的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，其中包括來(lái)自23個(gè)組織和器官的，超過(guò)350000個(gè)細(xì)胞的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)，這些細(xì)胞來(lái)自雄性和雌性C57BL/6JN小鼠的6個(gè)年齡段，從1一個(gè)月到30個(gè)月（圖1a）。用于單細(xì)胞的器官有膀胱，骨髓，大腦（小腦，皮質(zhì)，海馬和紋狀體），脂肪（棕色，性腺，腸系膜和皮下），心臟和主動(dòng)脈，腎臟，大腸，肢體肌肉和膈肌，肝，肺，乳腺，胰腺， 皮膚，脾臟，胸腺，舌頭和氣管。
    采用微流體滴法(droplet)技術(shù)收集所有組織和器官的6個(gè)年齡組的數(shù)據(jù)；3個(gè)月，18個(gè)月和24個(gè)月的時(shí)間點(diǎn)也用微孔板的單細(xì)胞分選技術(shù)(熒光活化細(xì)胞分選，F(xiàn)ACS)。來(lái)自3月齡小鼠的數(shù)據(jù)占整個(gè)數(shù)據(jù)集中約20％的細(xì)胞，并用作其他時(shí)間點(diǎn)對(duì)數(shù)據(jù)執(zhí)行細(xì)胞類(lèi)型注釋的基礎(chǔ)（圖1b）。使用這種方法，能夠自動(dòng)注釋超過(guò)70%的細(xì)胞。使用無(wú)偏差的方法對(duì)注釋校正后的細(xì)胞聚類(lèi)（圖1c，d），并評(píng)估在相同聚類(lèi)中相似注釋的同時(shí)出現(xiàn)的細(xì)胞。例如，注解為B細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞傾向于占據(jù)相同的簇，而不論其來(lái)源組織或處理方法（圖1e，f）。

圖1 Tabula Muris Senis總覽

    單細(xì)胞測(cè)序有可能在特殊的細(xì)胞類(lèi)型中發(fā)現(xiàn)與年齡相關(guān)的變化，并且單細(xì)胞數(shù)據(jù)使我們能夠了解在大量實(shí)驗(yàn)中觀察到的基因表達(dá)變化是由于群體中每個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)變化引起的，還是每個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)保持不變而該類(lèi)型的細(xì)胞數(shù)量發(fā)生變化，或者兩者都有引起的。作者觀察到，在多種情況下，基因的改變是兩者都有的。于是，作為代表性的例子，作者研究了表達(dá)Cdkn2a的細(xì)胞隨年齡變化的趨勢(shì)。Cdkn2a及其蛋白產(chǎn)物p16的表達(dá)是最常用的衰老標(biāo)記之一，也是衰老的重要標(biāo)志。根據(jù)FACS (Fig. 2a)和液滴(Fig. 2b)方法的分析，年老小鼠中表達(dá)Cdkn2a的細(xì)胞比例比年輕小鼠高出一倍以上，這伴隨著p16蛋白水平的兩倍的增長(zhǎng)(Fig. 2c-d)。值得注意的是，在30個(gè)月大的小鼠中，表達(dá)p16的細(xì)胞比例比24個(gè)月大的小鼠要小，這可能是因?yàn)殚L(zhǎng)壽的動(dòng)物衰老速度較慢。
    每種組織類(lèi)型的細(xì)胞組成往往隨年齡而變化。由于分離對(duì)組織中所有細(xì)胞類(lèi)型的影響并不相同，因此，相對(duì)于比較不同細(xì)胞類(lèi)型在同一年齡的比例，特定細(xì)胞類(lèi)型的相對(duì)組成隨年齡的變化更有意義。隨著年齡的增長(zhǎng)，膀胱細(xì)胞類(lèi)型的組成發(fā)生了明顯的變化(圖2e) ：然而，該組織的間充質(zhì)間室在小鼠的一生中減少了三倍(圖2e，左)，尿路上皮間室增加了相似的數(shù)量(圖2e，右)。利用差異基因表達(dá)分析評(píng)估組織隨年齡的整體變化，我們發(fā)現(xiàn)基質(zhì)相關(guān)基因(Col1a1、Col1a2、Col3a1和Dcn)下調(diào)，而上皮相關(guān)基因(Krt15、Krt18和Sfn)上調(diào)(圖2f)。內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量的下降表明，小鼠膀胱老化可能與較低的器官血管化有關(guān)，這與最近的發(fā)現(xiàn)以及觀察到的血管相關(guān)基因的下調(diào)是一致的Htra1和Fos(圖2f)。白細(xì)胞數(shù)量的增加可能表明存在炎性組織微環(huán)境，這是衰老的常見(jiàn)標(biāo)志，與膀胱過(guò)度活動(dòng)癥的文獻(xiàn)一致，并且整個(gè)組織中Lgals3，Igfbp2和Ly6d的顯著過(guò)表達(dá)也支持這種情況（圖2f），以及膀胱（間充質(zhì)）細(xì)胞和膀胱尿路上皮細(xì)胞中與免疫反應(yīng)相關(guān)的基因（例如Tnfrsf12a和Cdkn1a）的過(guò)表達(dá)。此外，在不同年齡段進(jìn)行比較時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞中促炎性標(biāo)記物（例如Cd14，Lgals3和Tnfrsf12a）的表達(dá)增加，而抗炎性標(biāo)記物（例如Cd9和Cd81）的表達(dá)減少。
    年齡相關(guān)的腎臟變化包括系膜細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、亨利升肢環(huán)上皮細(xì)胞和亨利增厚升肢環(huán)上皮細(xì)胞相對(duì)豐度的減少(圖2g)。系膜細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞都是腎小球的核心細(xì)胞，它們的相對(duì)豐度隨著年齡的增長(zhǎng)而減少(圖2g，上)，同時(shí)組織范圍內(nèi)減少Egf和Atp1a1表達(dá)(圖2h)——提示腎小球?yàn)V過(guò)率受損。值得注意的是，在毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞中，局部Atp1a1的表達(dá)均隨年齡增長(zhǎng)而增加，這表明有一種補(bǔ)償機(jī)制抵消了這些細(xì)胞隨年齡增長(zhǎng)比例下降的影響。差異基因表達(dá)分析的結(jié)果表明，umod(編碼尿調(diào)蛋白，尿蛋白中最豐富的蛋白)的表達(dá)也在整個(gè)組織中減少。尿調(diào)節(jié)蛋白是由排列在髓袢升支粗段的上皮細(xì)胞產(chǎn)生的，因此，鑒于其上皮細(xì)胞比例的相對(duì)降低，表明正常的腎功能受損 (圖2g圖2h）。與Atp1a1一樣，Umod的表達(dá)在細(xì)胞類(lèi)型中增加，而這種細(xì)胞類(lèi)型隨著年齡的增長(zhǎng)而變得越來(lái)越少，導(dǎo)致其在器官中的表達(dá)整體減少。
    在脾臟，T細(xì)胞的比例隨著年齡的增長(zhǎng)而減少，而漿細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量增加(圖2i)。通過(guò)B細(xì)胞和漿細(xì)胞標(biāo)記基因Cd79a和Jchain(也稱為Igj)，和Cd3d的下調(diào)展現(xiàn)(圖2j)。同樣，在乳腺中，也觀察到T細(xì)胞數(shù)量的下降。年齡相關(guān)的T細(xì)胞數(shù)量減少與感染性疾病和癌癥的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，本文的結(jié)果表明，這種減少也可能發(fā)生在脾臟和乳腺。附圖5中例述了乳腺T細(xì)胞和前體B細(xì)胞，皮膚干細(xì)胞的變化及基因表達(dá)差異。此外，基因編碼AP1轉(zhuǎn)錄因子（Junb, Jund and Fos）隨年齡增長(zhǎng)時(shí)上調(diào)。

圖2 衰老中的細(xì)胞類(lèi)型的改變

    基因組不穩(wěn)定性是最廣泛研究的老化特征之一，全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)使分析體細(xì)胞突變隨年齡的積累成為可能。使用基因組分析工具kit39在所有FACS樣本中同時(shí)識(shí)別單核苷酸多態(tài)性。本文關(guān)注的是在特定組織中，每個(gè)年齡組至少75%的細(xì)胞中表達(dá)的基因，并觀察到在我們分析的所有器官中，與年齡相關(guān)的突變數(shù)量增加(圖3)舌頭和膀胱受影響最嚴(yán)重。對(duì)測(cè)序覆蓋范圍和基因表達(dá)水平進(jìn)行控制，并驗(yàn)證了突變的數(shù)量超過(guò)了擴(kuò)增和測(cè)序錯(cuò)誤的預(yù)期，(圖3)。盡管很難從轉(zhuǎn)錄組中推斷出全基因組的絕對(duì)突變率，但由于各種原因，轉(zhuǎn)錄組會(huì)夸大表觀突變率，因而我們觀察到的趨勢(shì)是對(duì)突變頻率和基因組穩(wěn)定性的有用的間接估計(jì)。

圖3 老化小鼠組織中的突變負(fù)擔(dān)

    衰老也會(huì)影響免疫系統(tǒng)，所以分析了整個(gè)機(jī)體B細(xì)胞和T細(xì)胞之間的克隆關(guān)系。分別使用singlecell-ige和示蹤劑對(duì)FACS數(shù)據(jù)中出現(xiàn)的B細(xì)胞和T細(xì)胞受體的序列進(jìn)行了計(jì)算重建。B細(xì)胞受體是6,050個(gè)細(xì)胞組裝(圖4a)，T細(xì)胞受體是6,000個(gè)細(xì)胞組裝(圖4b) 。在3個(gè)月大的老鼠中，裝配B細(xì)胞受體的細(xì)胞數(shù)量為1818個(gè)，18個(gè)月大的老鼠為1356個(gè)，24個(gè)月大的老鼠為2876個(gè)。對(duì)于B細(xì)胞和T細(xì)胞庫(kù)的克隆性變化表明24個(gè)月大小鼠的免疫系統(tǒng)對(duì)新病原體的反應(yīng)可能性較小。這證實(shí)了文獻(xiàn)報(bào)道，與年輕的個(gè)體相比，年長(zhǎng)的個(gè)體對(duì)新感染的脆弱性更高，而接種疫苗的收益則更低。
    最后，計(jì)算了總體多樣性評(píng)分，以確定哪些細(xì)胞類(lèi)型更容易隨年齡變化。觀察到源自大腦和腎臟的免疫系統(tǒng)細(xì)胞多樣性的顯著變化（圖4c）。在腦髓系小膠質(zhì)細(xì)胞中，3個(gè)月大的年輕小膠質(zhì)細(xì)胞聚類(lèi)1和6，而18個(gè)月大的和24個(gè)月大的小膠質(zhì)細(xì)胞絕大多數(shù)聚類(lèi)10，14，12(圖4d)。軌跡分析表明，年輕的小膠質(zhì)細(xì)胞在獲得老的小膠質(zhì)細(xì)胞的特征之前，會(huì)經(jīng)歷一個(gè)中間狀態(tài)，即以18個(gè)月大的小膠質(zhì)細(xì)胞為主的集群為代表。聚類(lèi)10、12和14主要包含18個(gè)月和24個(gè)月的小膠質(zhì)細(xì)胞。這些細(xì)胞上調(diào)主要的組織相容性復(fù)合體（MHC）I類(lèi)基因（H2-D1，H2-K1和B2m）以及與變性疾病相關(guān)的基因（例如Fth1）。與群集1和6（主要包含3個(gè)月的小膠質(zhì)細(xì)胞）進(jìn)行比較時(shí)，群集10、12和14中的基因表達(dá)富含干擾素反應(yīng)性或調(diào)節(jié)性基因（例如Oasl2，Oas1a，Ifit3，Rtp4，Bst2，Stat1，Irf7 ，Ifitm3，Usp18，Ifi204和Ifit2），提示該小膠質(zhì)細(xì)胞在促炎亞型的小鼠衰老的大腦中增加了。

圖4 衰老中的免疫系統(tǒng)圖

    此外，“年輕”和“老”簇之間差異表達(dá)基因的列表類(lèi)似于先前報(bào)道的阿爾茨海默氏病特異性小膠質(zhì)細(xì)胞信號(hào)，在兩個(gè)差異基因表達(dá)列表之間的前200個(gè)差異表達(dá)基因中有55個(gè)相同（圖4e）。關(guān)于腎臟巨噬細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)簇，其組成隨年齡顯著變化。聚類(lèi)10主要由1個(gè)月大和3個(gè)月大的小鼠細(xì)胞組成，而聚類(lèi)13主要由18個(gè)月大，21個(gè)月大，24個(gè)月和30個(gè)月大的細(xì)胞組成。老年小鼠（圖4f）?；虮磉_(dá)差異顯示簇10富含M2巨噬細(xì)胞基因標(biāo)志物（例如Il10，H2-Eb1，H2-Ab1，H2-Aa，Cd74，C1qa，Cxcl16，Hexb，Cd81，C1qb和Cd72）。簇13細(xì)胞類(lèi)似于M1促炎性巨噬細(xì)胞狀態(tài)，（例如，Hp，Itgal，Msrb1和Gngt2）（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖11f，補(bǔ)充表10）。

補(bǔ)充圖11f. 第10群(主要是年輕巨噬細(xì)胞)與第13群(主要是老巨噬細(xì)胞)差異基因表達(dá)分析的熱圖

    總之，本文獲得的“單細(xì)胞小鼠衰老細(xì)胞圖集”，作者也稱之為“Tabula Muris Senis”，它是細(xì)胞生物學(xué)界的綜合資源，它提供了詳細(xì)的分子和細(xì)胞類(lèi)型特定的衰老肖像。這樣的細(xì)胞圖譜是基因組必不可少的伴侶：基因組提供了生物體的藍(lán)圖，但沒(méi)有解釋基因是如何以細(xì)胞類(lèi)型特定的方式使用的，也沒(méi)有解釋基因的使用在生物體的整個(gè)生命周期中是如何變化的。細(xì)胞圖譜提供了表型和生理學(xué)的深層特征，并為理解哺乳動(dòng)物在其生命周期中發(fā)生的細(xì)胞生物學(xué)變化的許多方面提供了參考。
參考文獻(xiàn)：
Tabula Muris Consortium.(2020). A single-cell transcriptomic atlas characterizes ageing tissues in the mouse. Nature, 583(7817), 590-595. doi:10.1038/s41586-020-2496-1