miR-541增強索拉非尼對肝癌的療效

    肝細胞癌(HCC)嚴重威脅著人類健康。索拉非尼是一種被批準為治療晚期HCC的一線系統(tǒng)性靶向藥物，但治療耐藥性降低了其臨床療效。自噬在HCC中也發(fā)揮促進腫瘤發(fā)生、維持腫瘤生長、增強轉(zhuǎn)移的作用。靶向自噬相關(guān)基因的miRNAs的失調(diào)可能導致索拉非尼耐藥，促進HCC細胞的生長?；谝陨涎芯勘尘?，大海軍醫(yī)大學Wen-Ping Xu等人在Hepatology雜志上發(fā)表文章，研究miR-541在肝癌治療中的作用。

技術(shù)路線圖：

研究結(jié)果：
1.miR-541的下調(diào)與肝癌患者短生存期和高復(fù)發(fā)率相關(guān)
    首先查閱miR-541在HCC患者中的預(yù)后價值(搜索www.kmplot.com)。miR-541水平越低，HCC患者的總生存期(OS)越短(圖1A)。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中miR-541的表達顯著降低(圖1B)。HCC樣本中低水平的miR-541也與HCC患者較短的OS相關(guān)(圖1D)。低miR-541表達組的復(fù)發(fā)率明顯高于高miR-541表達組(48.4% vs 27.2%， p=0.029;圖1E)。結(jié)果表明miR-541的表達在臨床上與癌癥復(fù)發(fā)和患者預(yù)后相關(guān)。

2. 在體內(nèi)外，miR-541抑制肝癌細胞HCC的惡性表型
    過表達miR-541可顯著抑制體外HCC細胞的增殖、集落形成、遷移和侵襲(圖2A-E)。相反，抑制miR-541會增加HCC細胞的惡性表型(圖2A-E)。此外，Ad-miR-541(過表達miR-541的腺病毒)組的移植瘤小鼠腫瘤生長和腫瘤重量顯著降低(圖2F-H)。細胞移植4周后的體外成像顯示，Ad-Max組老鼠在5只（共9只）小鼠骨頭中檢測到熒光，但是Ad-miR-541組在2只（共9只）小鼠骨頭中檢測到熒光(圖2 I和J)。在Ad-Max組的9只小鼠中有3只在肺中檢測到熒光素酶信號，而在Ad-miR-541組的10只小鼠中只有1只檢測到熒光素酶信號(圖2 I和J)。組織學分析證實Ad-miR-541組在骨骼和肺部有較小的腫瘤病灶(圖2K)。這些數(shù)據(jù)表明miR-541在HCC中具有強大的腫瘤抑制作用。

3. 在體內(nèi)外，miR-541抑制肝癌細胞自噬
    LC3 I轉(zhuǎn)變?yōu)長C3 II是自噬的一個標志。P62是自噬通量被抑制時細胞內(nèi)積累的自噬受體。miR-541過表達降低了HCC細胞中LC3 II的水平，增強了P62的水平。相反，抑制miR-541可增加HCC細胞中LC3 II的水平，降低P62的表達(圖3A)。免疫化學染色顯示, Ad-miR-541處理的皮下異種移植中，LC3陽性腫瘤細胞較少，P62陽性腫瘤細胞較多(圖3B和C)。TEM顯示Ad-miR-541減少了肝癌細胞的自噬小體數(shù)量(圖3 D和E)。使用mRFP-GFP-LC3報告基因構(gòu)建的活細胞成像顯示，自噬通量的比率在miR-541過表達時顯著受到抑制，而在miR-541過表達時增強(圖3F和G).

4. ATG2A和RAB1B是miR-541的兩個直接靶點
    Targetscan, miRDB, microRNA.org, DIANA-microT, TARGETMINER和RNA22,暗示miRNA-541和ATG2A,RAB1B之間的相互作用 (圖4 A和B),這些是自噬功能重要的調(diào)控作用。在過表達miRNA-541的肝癌細胞中，ATG2A 和RAB1B 的mRNAs和蛋白水平降低。miRNA-541抑制劑增加其表達(圖4 C和D)。ATG2A mRNA 3’UTR中mir-541的兩個結(jié)合位點和RAB1B mRNA 3’UTR中miR-541的四個潛在結(jié)合位點(圖4 A和B)。熒光素酶標記實驗顯示ATG2A和RAB1B 3’ UTR是miR-541的直接靶標(圖4 E, F)。此外,WB和IHC發(fā)現(xiàn),在人類肝癌樣本中,miR-541水平的增加伴隨著ATG2A和RAB1B蛋白質(zhì)表達減少(圖4 G和H)。并且ATG2A和RAB1B的水平與miR-541水平負相關(guān)。 (圖4I和J)。

5.在肝癌細胞HCC中，ATG2A和RAB1B促進癌癥和自噬
    生存曲線顯示ATG2A和RAB1B mRNAs的高表達與較差的預(yù)后相關(guān)，這與miR-541的臨床意義相反(圖5A和B)。siATG2A和 siRAB1B抑制增殖,集落形成,肝癌細胞的遷移和入侵(圖5C-I)。此外,siATG2A和siRAB1B降低 LC3 II的水平,增加了肝癌細胞中P62表達 (圖5J)和阻止自噬小體合成(圖5 K和L)。這些結(jié)果表明ATG2A和RAB1B是肝癌細胞自噬的癌基因和陽性調(diào)節(jié)因子。

6. miR-541通過下調(diào)ATG2A和RAB1B抑制HCC的進展和自噬
    在轉(zhuǎn)染siATA2A和siRAB1B的細胞中，miR-541抑制劑增加HCC細胞的增殖、遷移和侵襲的作用顯著降低(圖6A-F)。miR - 541抑制劑在促進自噬中的作用也被siATG2A和siRAB1B逆轉(zhuǎn)了(圖6 G和H)。總的來說,ATG2A和RAB1B的下調(diào)至少在一定程度上有助于影響miR-541在肝癌細胞中的作用。

7.在體內(nèi)外，miR-541增強索拉非尼誘導的肝癌細胞死亡
    自噬加重索拉非尼耐藥。Kaplan-Meier生存分析顯示，高miR-541水平的HCC患者受益于索拉非尼治療，而低miR-541表達的患者則不受益(圖7A)。此外，轉(zhuǎn)染miR-541 mimic的HCC細胞比對照細胞對索拉非尼更敏感，而轉(zhuǎn)染miR-541 inhibitor的細胞對索拉非尼更耐藥（IC50結(jié)果）(圖7B-E)。Ad-miR-541和索拉非尼都抑制了腫瘤的生長、體積和重量(圖7F和H)。IHC染色顯示， Ad-miR-541或索拉非尼處理的腫瘤中Ki-67陽性細胞數(shù)量減少，而Ad-miR-541和索拉非尼聯(lián)合處理的腫瘤中Ki-67水平進一步降低(圖7I)。此外， Ad-miR-541或Ad-miR-541聯(lián)合索拉非尼治療可導致ATG2A和RAB1B表達明顯下降，而索拉非尼治療可導致ATG2A和RAB1B表達升高(圖7I)?？偟膩碚f，索拉非尼對HCC生長的抑制作用可通過miR-541增強，這至少部分歸因于其對ATG2A和RAB1B表達的調(diào)控作用。

總結(jié)：
研究強調(diào)了miR-541在HCC中的生物學意義，并闡明了其在HCC病程中的分子機制。
研究為HCC的個體化治療提供了三個新的治療靶點和預(yù)后標記。
本研究的結(jié)果將有益于肝癌的治療。