頭頸癌細(xì)胞鐵死亡的奧秘

        鐵硫簇合功能的喪失通過上調(diào)鐵饑餓反應(yīng)使癌細(xì)胞易發(fā)生鐵死亡，但谷氧還蛋白5（GLRX5）沉默在鐵死亡中的作用尚不清楚。今天小編為大家介紹一篇發(fā)表于影響因子為8.579的“Theranostics”的文章“Inhibition of Glutaredoxin 5 predisposes Cisplatin-resistant Head and Neck Cancer Cells to Ferroptosis”，帶大家了解GLRX5功能喪失在促進(jìn)順鉑耐藥頭頸癌（HNC）細(xì)胞鐵死亡中的作用。
       在本文中，我們研究了磺胺嘧啶治療和GLRX5基因沉默對(duì)HNC細(xì)胞系和小鼠腫瘤異種移植模型的影響。我們通過細(xì)胞活力和死亡、脂質(zhì)活性氧（ROS）和線粒體鐵產(chǎn)生、不穩(wěn)定鐵池、mRNA/蛋白表達(dá)和丙二醛測(cè)定對(duì)此進(jìn)行分析。
技術(shù)路線：

結(jié)果：
1.抑制GLRX5促進(jìn)HNC細(xì)胞鐵性細(xì)胞死亡
        Cyst(e)ine deprivation、erastin或SAS會(huì)誘導(dǎo)HNC細(xì)胞系鐵死亡。HN3和HN4細(xì)胞的存活率以Cyst(e)ine deprivation的時(shí)間依賴性方式和erastin或SAS的劑量依賴性方式降低（圖1A-C）。與HN3和HN4細(xì)胞相比，耐順鉑的HN3R和HN4R細(xì)胞對(duì)Cyst(e)ine deprivation、erastin或SAS治療的敏感性相對(duì)較低。接下來我們驗(yàn)證了順鉑耐藥的HNC細(xì)胞鐵死亡誘導(dǎo)劑的低敏感性是否通過抑制GLRX5來克服的。GLRX5的基因沉默顯著增加了SAS誘導(dǎo)的鐵死亡引起的HN3R和HN4R的PI陽性細(xì)胞分?jǐn)?shù)（圖1D-F）。去鐵胺預(yù)處理或與鐵抑制素-1或α-生育酚聯(lián)合處理可抑制細(xì)胞死亡。當(dāng)siGLRX5轉(zhuǎn)染到兩個(gè)HNC細(xì)胞系中時(shí)，GLRX5的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)顯著降低（圖1G，1H）。此外，與載體對(duì)照組相比，GLRX5基因沉默也顯著增加了SAS處理的癌細(xì)胞的脂質(zhì)ROS生成（圖1G–I）。

2.GLRX5基因沉默增加鐵死亡和脂質(zhì)過氧化
        當(dāng)shGLRX5或載體在HN4和HN4R細(xì)胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)化時(shí)，經(jīng)SAS處理的兩種細(xì)胞系中PI陽性細(xì)胞分?jǐn)?shù)顯著增加（圖2A-B）。穩(wěn)定的shGLRX5轉(zhuǎn)導(dǎo)可顯著降低GLRX5的蛋白表達(dá)，但不影響xCT和GPX4這兩個(gè)與鐵死亡相關(guān)的關(guān)鍵分子（圖2C）。SAS誘導(dǎo)HNC細(xì)胞總ROS和脂質(zhì)ROS水平顯著升高，GSH含量降低。與非載體或載體對(duì)照組相比，隨著GLRX5基因沉默，細(xì)胞和脂質(zhì)ROS顯著增加（圖2D-E）。SAS處理降低了GSH水平，但對(duì)照組和shGLRX5基因沉默的HN4R細(xì)胞之間的GSH含量變化沒有顯著差異（圖2F）。

3.抑制GLRX5可提高細(xì)胞內(nèi)游離鐵水平
        在順鉑耐藥的HN3R和HN4R細(xì)胞中建立了穩(wěn)定的GRX-shRNA和載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。SAS處理可顯著提高HNC細(xì)胞的不穩(wěn)定鐵和亞鐵（Fe2+）水平。SAS治療后LIP增加，shGLRX5轉(zhuǎn)化的癌細(xì)胞的LIP顯著高于非載體和載體對(duì)照組（圖3A-B）。SAS治療后，shGLRX5轉(zhuǎn)化的癌細(xì)胞的細(xì)胞和線粒體Fe2+水平顯著高于對(duì)照組（圖3C-D）。

4.抗GLRX5 cDNA可挽救鐵死亡和游離鐵增加
    用靶向于GLRX5和耐GLRX5 cDNA（GLRX5res）或無催化活性的突變GLRX5 cDNA（GLRX5res K101Q）共或不共轉(zhuǎn)導(dǎo)的shRNA轉(zhuǎn)染順鉑耐藥的HN4R細(xì)胞。GLRX5res轉(zhuǎn)導(dǎo)恢復(fù)了HN4R細(xì)胞中由shGLRX5穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制的GLRX5蛋白表達(dá)（圖4A）。經(jīng)SAS處理的shGLRX5轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的PI陽性細(xì)胞分?jǐn)?shù)比載體對(duì)照增加更多，而在shGLRX5和GLRX5res轉(zhuǎn)染的HN4R細(xì)胞中，PI陽性細(xì)胞百分率恢復(fù)到載體對(duì)照水平（圖4B）。shGLRX5基因沉默可顯著增加SAS治療后脂質(zhì)ROS、LIP、游離鐵和線粒體鐵的積累，GLRX5res轉(zhuǎn)導(dǎo)可使其恢復(fù)（圖4C-F）。

5.抑制GLRX5可上調(diào)缺鐵反應(yīng)
    在HN4R細(xì)胞中建立了穩(wěn)定的shGLRX5和一個(gè)抗性GLRX5res cDNA或一個(gè)無催化活性突變的GLRX5res K101Q cDNA的穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)。GLRX5基因沉默增強(qiáng)了SAS治療后的鐵饑餓反應(yīng)。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shGLRX5的HN4R細(xì)胞中進(jìn)行SAS處理后，TfR1和IRP2的蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)增加，但FTH1和Fpn的蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)減少，通過共轉(zhuǎn)導(dǎo)耐藥的GLRX5res而恢復(fù)（圖5A-D）。此外，GLRX5基因沉默可顯著降低烏頭酸酶和α-KGDH活性，GLRX5res轉(zhuǎn)導(dǎo)可恢復(fù)它們的活性（圖5E-F）。GLRX5的蛋白質(zhì)表達(dá)受到shGLRX5轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制，而GLRX5res或GLRX5res K101Q則恢復(fù)了這種表達(dá)（圖5G）。除了SAS治療外，GLRX5基因沉默導(dǎo)致增加的PI陽性細(xì)胞分?jǐn)?shù)也被GLRX5res挽救（圖5H）。

6.GLRX5抑制可使抗治療HNC細(xì)胞對(duì)SAS治療敏感
    所有小鼠在腫瘤細(xì)胞植入及SAS或載體治療期間及之后均存活良好。他們?cè)谥委?8天后被死。轉(zhuǎn)染載體和shGLRX5的癌細(xì)胞之間的腫瘤體積和重量沒有差異（圖6A-B）。與載體對(duì)照組相比，SAS治療能顯著抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)，這一點(diǎn)在shGLRX5轉(zhuǎn)化癌細(xì)胞移植的小鼠體內(nèi)更為顯著。對(duì)照組和SAS治療組的體重和每日食物攝入量沒有顯著變化（圖6C）。SAS治療的腫瘤組織中脂質(zhì)ROS、RPA和亞鐵的水平顯著高于載體對(duì)照組（圖6D-F）。此外，SAS治療后shGLRX5轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤中的脂質(zhì)ROS、RPA和亞鐵水平的增加明顯高于載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤。GLRX5沉默導(dǎo)致TfR1增加和Fpn降低（圖6G）。當(dāng)腫瘤經(jīng)歷GLRX5沉默時(shí)，SAS治療的腫瘤組織中脂質(zhì)ROS、MDA濃度的最終產(chǎn)物增加更多（圖6H）。

結(jié)論：
GLRX5的抑制通過增加細(xì)胞內(nèi)游離鐵和脂質(zhì)過氧化，促進(jìn)鐵死亡。增強(qiáng)的鐵死亡被GLRX5res挽救?？傊?，GLRX5的抑制使耐治療的HNC細(xì)胞易發(fā)生鐵死亡。