頭頸癌細(xì)胞鐵死亡的奧秘

欄目:最新研究動態(tài) 發(fā)布時間:2020-11-04
鐵硫簇合功能的喪失通過上調(diào)鐵饑餓反應(yīng)使癌細(xì)胞易發(fā)生鐵死亡,但谷氧還蛋白5(GLRX5)沉默在鐵死亡中的作用尚不清楚...

        鐵硫簇合功能的喪失通過上調(diào)鐵饑餓反應(yīng)使癌細(xì)胞易發(fā)生鐵死亡,但谷氧還蛋白5(GLRX5)沉默在鐵死亡中的作用尚不清楚。今天小編為大家介紹一篇發(fā)表于影響因子為8.579的“Theranostics”的文章“Inhibition of Glutaredoxin 5 predisposes Cisplatin-resistant Head and Neck Cancer Cells to Ferroptosis”,帶大家了解GLRX5功能喪失在促進(jìn)順鉑耐藥頭頸癌(HNC)細(xì)胞鐵死亡中的作用。
       在本文中,我們研究了磺胺嘧啶治療和
GLRX5基因沉默對HNC細(xì)胞系和小鼠腫瘤異種移植模型的影響。我們通過細(xì)胞活力和死亡、脂質(zhì)活性氧(ROS)和線粒體鐵產(chǎn)生、不穩(wěn)定鐵池、mRNA/蛋白表達(dá)和丙二醛測定對此進(jìn)行分析。
技術(shù)路線:

結(jié)果:
1.抑制GLRX5促進(jìn)HNC細(xì)胞鐵性細(xì)胞死亡
        Cyst(e)ine deprivation、erastin或SAS會誘導(dǎo)HNC細(xì)胞系鐵死亡。HN3和HN4細(xì)胞的存活率以Cyst(e)ine deprivation的時間依賴性方式和erastin或SAS的劑量依賴性方式降低(圖1A-C)。與HN3和HN4細(xì)胞相比,耐順鉑的HN3R和HN4R細(xì)胞對Cyst(e)ine deprivation、erastin或SAS治療的敏感性相對較低。接下來我們驗證了順鉑耐藥的HNC細(xì)胞鐵死亡誘導(dǎo)劑的低敏感性是否通過抑制GLRX5來克服的。GLRX5的基因沉默顯著增加了SAS誘導(dǎo)的鐵死亡引起的HN3R和HN4R的PI陽性細(xì)胞分?jǐn)?shù)(圖1D-F)。去鐵胺預(yù)處理或與鐵抑制素-1或α-生育酚聯(lián)合處理可抑制細(xì)胞死亡。當(dāng)siGLRX5轉(zhuǎn)染到兩個HNC細(xì)胞系中時,GLRX5的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)顯著降低(圖1G,1H)。此外,與載體對照組相比,GLRX5基因沉默也顯著增加了SAS處理的癌細(xì)胞的脂質(zhì)ROS生成(圖1G–I)。

2.GLRX5基因沉默增加鐵死亡和脂質(zhì)過氧化
        當(dāng)shGLRX5或載體在HN4和HN4R細(xì)胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)化時,經(jīng)SAS處理的兩種細(xì)胞系中PI陽性細(xì)胞分?jǐn)?shù)顯著增加(圖2A-B)。穩(wěn)定的shGLRX5轉(zhuǎn)導(dǎo)可顯著降低GLRX5的蛋白表達(dá),但不影響xCT和GPX4這兩個與鐵死亡相關(guān)的關(guān)鍵分子(圖2C)。SAS誘導(dǎo)HNC細(xì)胞總ROS和脂質(zhì)ROS水平顯著升高,GSH含量降低。與非載體或載體對照組相比,隨著GLRX5基因沉默,細(xì)胞和脂質(zhì)ROS顯著增加(圖2D-E)。SAS處理降低了GSH水平,但對照組和shGLRX5基因沉默的HN4R細(xì)胞之間的GSH含量變化沒有顯著差異(圖2F)。

3.抑制GLRX5可提高細(xì)胞內(nèi)游離鐵水平
        在順鉑耐藥的HN3R和HN4R細(xì)胞中建立了穩(wěn)定的GRX-shRNA和載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。SAS處理可顯著提高HNC細(xì)胞的不穩(wěn)定鐵和亞鐵(Fe2+)水平。SAS治療后LIP增加,shGLRX5轉(zhuǎn)化的癌細(xì)胞的LIP顯著高于非載體和載體對照組(圖3A-B)。SAS治療后,shGLRX5轉(zhuǎn)化的癌細(xì)胞的細(xì)胞和線粒體Fe2+水平顯著高于對照組(圖3C-D)。

4.抗GLRX5 cDNA可挽救鐵死亡和游離鐵增加
    用靶向于GLRX5和耐GLRX5 cDNA(GLRX5res)或無催化活性的突變GLRX5 cDNA(GLRX5res K101Q)共或不共轉(zhuǎn)導(dǎo)的shRNA轉(zhuǎn)染順鉑耐藥的HN4R細(xì)胞。GLRX5res轉(zhuǎn)導(dǎo)恢復(fù)了HN4R細(xì)胞中由shGLRX5穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制的GLRX5蛋白表達(dá)(圖4A)。經(jīng)SAS處理的shGLRX5轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的PI陽性細(xì)胞分?jǐn)?shù)比載體對照增加更多,而在shGLRX5和GLRX5res轉(zhuǎn)染的HN4R細(xì)胞中,PI陽性細(xì)胞百分率恢復(fù)到載體對照水平(圖4B)。shGLRX5基因沉默可顯著增加SAS治療后脂質(zhì)ROS、LIP、游離鐵和線粒體鐵的積累,GLRX5res轉(zhuǎn)導(dǎo)可使其恢復(fù)(圖4C-F)。

5.抑制GLRX5可上調(diào)缺鐵反應(yīng)
    在HN4R細(xì)胞中建立了穩(wěn)定的shGLRX5和一個抗性GLRX5res cDNA或一個無催化活性突變的GLRX5res K101Q cDNA的穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)。GLRX5基因沉默增強了SAS治療后的鐵饑餓反應(yīng)。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shGLRX5的HN4R細(xì)胞中進(jìn)行SAS處理后,TfR1和IRP2的蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)增加,但FTH1和Fpn的蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)減少,通過共轉(zhuǎn)導(dǎo)耐藥的GLRX5res而恢復(fù)(圖5A-D)。此外,GLRX5基因沉默可顯著降低烏頭酸酶和α-KGDH活性,GLRX5res轉(zhuǎn)導(dǎo)可恢復(fù)它們的活性(圖5E-F)。GLRX5的蛋白質(zhì)表達(dá)受到shGLRX5轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制,而GLRX5res或GLRX5res K101Q則恢復(fù)了這種表達(dá)(圖5G)。除了SAS治療外,GLRX5基因沉默導(dǎo)致增加的PI陽性細(xì)胞分?jǐn)?shù)也被GLRX5res挽救(圖5H)。

6.GLRX5抑制可使抗治療HNC細(xì)胞對SAS治療敏感
    所有小鼠在腫瘤細(xì)胞植入及SAS或載體治療期間及之后均存活良好。他們在治療28天后被死。轉(zhuǎn)染載體和shGLRX5的癌細(xì)胞之間的腫瘤體積和重量沒有差異(圖6A-B)。與載體對照組相比,SAS治療能顯著抑制體內(nèi)腫瘤生長,這一點在shGLRX5轉(zhuǎn)化癌細(xì)胞移植的小鼠體內(nèi)更為顯著。對照組和SAS治療組的體重和每日食物攝入量沒有顯著變化(圖6C)。SAS治療的腫瘤組織中脂質(zhì)ROS、RPA和亞鐵的水平顯著高于載體對照組(圖6D-F)。此外,SAS治療后shGLRX5轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤中的脂質(zhì)ROS、RPA和亞鐵水平的增加明顯高于載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤。GLRX5沉默導(dǎo)致TfR1增加和Fpn降低(圖6G)。當(dāng)腫瘤經(jīng)歷GLRX5沉默時,SAS治療的腫瘤組織中脂質(zhì)ROS、MDA濃度的最終產(chǎn)物增加更多(圖6H)。

結(jié)論:
GLRX5的抑制通過增加細(xì)胞內(nèi)游離鐵和脂質(zhì)過氧化,促進(jìn)鐵死亡。增強的鐵死亡被GLRX5res挽救??傊珿LRX5的抑制使耐治療的HNC細(xì)胞易發(fā)生鐵死亡。