與蛋白相互作用的lncRNA又撬動了腫瘤轉移的杠桿

    LINC00941是一種新的lncRNA，已被發(fā)現(xiàn)在腫瘤發(fā)生過程中表現(xiàn)出起源性和促轉移性行為。然而，其在轉移性CRC中的作用仍不清楚。本文旨在研究LINC00941在CRC轉移中的作用及其機制，并于2020年7月31日發(fā)表在《Cell Death & Differentiation》IF: 10.717雜志上。
技術路線：

結果：
1、CRC中LINC00941表達上調與預后不良相關
    作者首先通過組織芯片ISH染色發(fā)現(xiàn)LINC00941主要定位與染色質中，并且在癌組織中的表達顯著高于癌旁組織，且高表達的病人預后較差。然后TCGA數(shù)據(jù)庫分析得出了一樣的結論，不僅如此，ISH染色進一步發(fā)現(xiàn)在轉移結節(jié)中其表達量更高，在轉移性CRC細胞系的表達也都顯著高于其它細胞系?？傊?，CRC中LINC00941表達上調與預后不良相關。

圖1 CRC中LINC00941表達上調與預后不良相關

2、LINC00941促進CRC細胞遷移和侵襲能力，激活EMT
    體外功能實驗結果與預期一致，敲除LINC00941后CRC細胞的遷移和侵襲表型顯著抑制。類似的，敲除敲除LINC00941后CRC細胞的EMT分子標志物的表達顯著下降，過表達則相反。這些說明LINC00941促進CRC細胞遷移和侵襲能力，激活EMT。

圖2 LINC00941促進結直腸癌細胞的遷移和侵襲能力

3、LINC00941通過抑制SMAD4的泛素化增強了其蛋白穩(wěn)定性
    鑒于lncRNA通常通過RNA-蛋白質相互作用的方式影響基因的表達，因此，作者檢測了能與LINC00941相互作用的蛋白以獲得LINC00941誘導EMT的深層次的分子機制。RNA pulldown及質譜實驗檢測到SMAD4蛋白在LoVo-Sh- LINC00941細胞中下調，在HCT-116-LINC00941中上調，因而引起了作者的注意。隨后WB和RIP實驗證實LINC00941和SMAD4存在相互作用。之后，通過截短實驗，發(fā)現(xiàn)LINC00941的1465-1895區(qū)間可以與SMAD4結合，而SMAD4的MH2區(qū)域和全長可以與LINC00941結合，表明LINC00941與SMAD4存在結合作用。細胞質lncRNA通常通過準路后調控修飾蛋白。CHX實驗結果顯示LINC00941增強了SMAD4蛋白的穩(wěn)定性通過延長其降解半衰期。為了明確LINC00941誘導SMAD4降解的深層機制，使用蛋白酶體抑制劑(MG132)處理LoVo-Sh-LINC00941細胞。通過WB分析發(fā)現(xiàn)MG132可顯著恢復LoVo-Sh-LINC00941細胞中SMAD4蛋白水平，這表明LINC00941誘導的SMAD4蛋白降解是由泛素-蛋白酶體途徑介導的?？傊?，上述結果表明CRC細胞中LINC00941可以通過抑制SMAD4的泛素化穩(wěn)定其表達。

圖3 LINC00941促進SMAD4蛋白的穩(wěn)定性

4、LINC00941通過與β-TrCP競爭抑制SMAD4泛素化
    文獻報道，SMAD4可以被β-TrCP多聚泛素化并降解，因此作者研究了β-TrCP在CRC細胞中SMAD4泛素化和降解的功能重要性。結果表明抑制β-TrCP的表達可以增加SMAD4的表達，并減少LoVo和HCT-116細胞中的SMAD4的泛素化水平。進一步的，研究發(fā)現(xiàn)LINC00941的缺失顯著增加了SMAD4和β-TrCP的結合，相反，過表達LINC00941則顯著抑制了SMAD4與β-TrCP的結合。不僅如此，作者發(fā)現(xiàn)SMAD4的MH2區(qū)域和全長可以與β-TrCP結合，這暗示著β-TrCP控制了SMAD4的泛素化和降解通過MH2區(qū)域和全長。因此，作者猜測LINC00941與β-TrCP可能存在競爭性結合SMAD4的關系，而這一猜測通過競爭性RNA pulldown實驗得到證實?？傊?，這些結果表明LINC00941通過與β-TrCP競爭性結合SMAD4抑制其降解從而增強了其穩(wěn)定性。

圖4 LINC00941通過阻斷SMAD4與βTrCP的結合抑制了SMAD4的泛素化

5、在轉移性CRC中，LINC00941被TGF- cad1上調，并與SMAD2/3信號通路的激活相關
    TGF-β1/SMAD信號通路是EMT的關鍵調節(jié)因子，SMAD4是重要的輔因子，可與活化的SMAD2和SMAD3結合形成調節(jié)目標基因轉錄的寡聚復合物。因此作者就評估了LINC00941在TGF-β1/ SMAD信號通路中的作用。結果顯示在LINC00941沉默的細胞中使用TGF-β1處理后LINC00941的表達，細胞的遷移和侵襲都顯著提高了，而使用TGF-β1抑制劑處理則效果相反。類似的，EMT標志物的表達水平也有一致的變化趨勢，這些結果提示TGF-β1參與了LINC00941誘導的EMT進程。重要的是，熒光素酶報告基因檢測顯示，TGF-β1處理后，報告基因的熒光素酶活性顯著增加。此外，使用TGF-β1處理的LoVo-Sh- LINC00941細胞處理的裸鼠具有的更多的轉移結節(jié)，并且預后更差。這些結果證實TGF-β1和LINC00941之間存在強烈的相互作用關系。

圖5在linc00941誘導的轉移促進中，TGF-β高表達是必要的

    總之，本文發(fā)現(xiàn)LINC00941通過抑制SMAD4蛋白降解，激活TGF-β/ SMAD2/3信號通路，促進CRC轉移(圖5k)，為轉移性CRC的機制提供了新的認識，并為晚期CRC提供了新的潛在治療靶點。
參考文獻：
Wu Nan., Jiang Mingzuo., Liu Haiming., Chu Yi., Wang Dan., Cao Jiayi., Wang Zhiyang., Xie Xin., Han Yuying., Xu Bing.(2020). LINC00941 promotes CRC metastasis through preventing SMAD4 protein degradation and activating the TGF-β/SMAD2/3 signaling pathway. Cell Death Differ., undefined(undefined), undefined. doi:10.1038/s41418-020-0596-y