與蛋白相互作用的lncRNA又撬動(dòng)了腫瘤轉(zhuǎn)移的杠桿

    LINC00941是一種新的lncRNA，已被發(fā)現(xiàn)在腫瘤發(fā)生過程中表現(xiàn)出起源性和促轉(zhuǎn)移性行為。然而，其在轉(zhuǎn)移性CRC中的作用仍不清楚。本文旨在研究LINC00941在CRC轉(zhuǎn)移中的作用及其機(jī)制，并于2020年7月31日發(fā)表在《Cell Death & Differentiation》IF: 10.717雜志上。
技術(shù)路線：

結(jié)果：
1、CRC中LINC00941表達(dá)上調(diào)與預(yù)后不良相關(guān)
    作者首先通過組織芯片ISH染色發(fā)現(xiàn)LINC00941主要定位與染色質(zhì)中，并且在癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，且高表達(dá)的病人預(yù)后較差。然后TCGA數(shù)據(jù)庫分析得出了一樣的結(jié)論，不僅如此，ISH染色進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)中其表達(dá)量更高，在轉(zhuǎn)移性CRC細(xì)胞系的表達(dá)也都顯著高于其它細(xì)胞系?？傊?，CRC中LINC00941表達(dá)上調(diào)與預(yù)后不良相關(guān)。

圖1 CRC中LINC00941表達(dá)上調(diào)與預(yù)后不良相關(guān)

2、LINC00941促進(jìn)CRC細(xì)胞遷移和侵襲能力，激活EMT
    體外功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期一致，敲除LINC00941后CRC細(xì)胞的遷移和侵襲表型顯著抑制。類似的，敲除敲除LINC00941后CRC細(xì)胞的EMT分子標(biāo)志物的表達(dá)顯著下降，過表達(dá)則相反。這些說明LINC00941促進(jìn)CRC細(xì)胞遷移和侵襲能力，激活EMT。

圖2 LINC00941促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力

3、LINC00941通過抑制SMAD4的泛素化增強(qiáng)了其蛋白穩(wěn)定性
    鑒于lncRNA通常通過RNA-蛋白質(zhì)相互作用的方式影響基因的表達(dá)，因此，作者檢測了能與LINC00941相互作用的蛋白以獲得LINC00941誘導(dǎo)EMT的深層次的分子機(jī)制。RNA pulldown及質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)檢測到SMAD4蛋白在LoVo-Sh- LINC00941細(xì)胞中下調(diào)，在HCT-116-LINC00941中上調(diào)，因而引起了作者的注意。隨后WB和RIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)LINC00941和SMAD4存在相互作用。之后，通過截短實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)LINC00941的1465-1895區(qū)間可以與SMAD4結(jié)合，而SMAD4的MH2區(qū)域和全長可以與LINC00941結(jié)合，表明LINC00941與SMAD4存在結(jié)合作用。細(xì)胞質(zhì)lncRNA通常通過準(zhǔn)路后調(diào)控修飾蛋白。CHX實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LINC00941增強(qiáng)了SMAD4蛋白的穩(wěn)定性通過延長其降解半衰期。為了明確LINC00941誘導(dǎo)SMAD4降解的深層機(jī)制，使用蛋白酶體抑制劑(MG132)處理LoVo-Sh-LINC00941細(xì)胞。通過WB分析發(fā)現(xiàn)MG132可顯著恢復(fù)LoVo-Sh-LINC00941細(xì)胞中SMAD4蛋白水平，這表明LINC00941誘導(dǎo)的SMAD4蛋白降解是由泛素-蛋白酶體途徑介導(dǎo)的?？傊鲜鼋Y(jié)果表明CRC細(xì)胞中LINC00941可以通過抑制SMAD4的泛素化穩(wěn)定其表達(dá)。

圖3 LINC00941促進(jìn)SMAD4蛋白的穩(wěn)定性

4、LINC00941通過與β-TrCP競爭抑制SMAD4泛素化
    文獻(xiàn)報(bào)道，SMAD4可以被β-TrCP多聚泛素化并降解，因此作者研究了β-TrCP在CRC細(xì)胞中SMAD4泛素化和降解的功能重要性。結(jié)果表明抑制β-TrCP的表達(dá)可以增加SMAD4的表達(dá)，并減少LoVo和HCT-116細(xì)胞中的SMAD4的泛素化水平。進(jìn)一步的，研究發(fā)現(xiàn)LINC00941的缺失顯著增加了SMAD4和β-TrCP的結(jié)合，相反，過表達(dá)LINC00941則顯著抑制了SMAD4與β-TrCP的結(jié)合。不僅如此，作者發(fā)現(xiàn)SMAD4的MH2區(qū)域和全長可以與β-TrCP結(jié)合，這暗示著β-TrCP控制了SMAD4的泛素化和降解通過MH2區(qū)域和全長。因此，作者猜測LINC00941與β-TrCP可能存在競爭性結(jié)合SMAD4的關(guān)系，而這一猜測通過競爭性RNA pulldown實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)?？傊?，這些結(jié)果表明LINC00941通過與β-TrCP競爭性結(jié)合SMAD4抑制其降解從而增強(qiáng)了其穩(wěn)定性。

圖4 LINC00941通過阻斷SMAD4與βTrCP的結(jié)合抑制了SMAD4的泛素化

5、在轉(zhuǎn)移性CRC中，LINC00941被TGF- cad1上調(diào)，并與SMAD2/3信號通路的激活相關(guān)
    TGF-β1/SMAD信號通路是EMT的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，SMAD4是重要的輔因子，可與活化的SMAD2和SMAD3結(jié)合形成調(diào)節(jié)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄的寡聚復(fù)合物。因此作者就評估了LINC00941在TGF-β1/ SMAD信號通路中的作用。結(jié)果顯示在LINC00941沉默的細(xì)胞中使用TGF-β1處理后LINC00941的表達(dá)，細(xì)胞的遷移和侵襲都顯著提高了，而使用TGF-β1抑制劑處理則效果相反。類似的，EMT標(biāo)志物的表達(dá)水平也有一致的變化趨勢，這些結(jié)果提示TGF-β1參與了LINC00941誘導(dǎo)的EMT進(jìn)程。重要的是，熒光素酶報(bào)告基因檢測顯示，TGF-β1處理后，報(bào)告基因的熒光素酶活性顯著增加。此外，使用TGF-β1處理的LoVo-Sh- LINC00941細(xì)胞處理的裸鼠具有的更多的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，并且預(yù)后更差。這些結(jié)果證實(shí)TGF-β1和LINC00941之間存在強(qiáng)烈的相互作用關(guān)系。

圖5在linc00941誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)移促進(jìn)中，TGF-β高表達(dá)是必要的

    總之，本文發(fā)現(xiàn)LINC00941通過抑制SMAD4蛋白降解，激活TGF-β/ SMAD2/3信號通路，促進(jìn)CRC轉(zhuǎn)移(圖5k)，為轉(zhuǎn)移性CRC的機(jī)制提供了新的認(rèn)識，并為晚期CRC提供了新的潛在治療靶點(diǎn)。
參考文獻(xiàn)：
Wu Nan., Jiang Mingzuo., Liu Haiming., Chu Yi., Wang Dan., Cao Jiayi., Wang Zhiyang., Xie Xin., Han Yuying., Xu Bing.(2020). LINC00941 promotes CRC metastasis through preventing SMAD4 protein degradation and activating the TGF-β/SMAD2/3 signaling pathway. Cell Death Differ., undefined(undefined), undefined. doi:10.1038/s41418-020-0596-y