Blood|人類(lèi)紅白血病遺傳學(xué)和轉(zhuǎn)錄組鑒定主轉(zhuǎn)錄因子為功能性疾病驅(qū)動(dòng)因子

     急性紅白血病(AML-M6或AEL)是一種罕見(jiàn)但侵襲性的血液惡性腫瘤。既往研究表明，AEL白血病細(xì)胞經(jīng)常攜帶復(fù)雜的核型和已知aml相關(guān)癌基因的突變。為了更好地定義驅(qū)動(dòng)紅細(xì)胞表型的潛在分子機(jī)制，我們研究了一系列33個(gè)AEL樣本，它們代表三個(gè)遺傳AEL亞群，包括TP53突變、表觀調(diào)控突變(如DNMT3A、TET2或IDH2)，以及低突變負(fù)荷的未定義病例。我們建立了一個(gè)基于紅髓轉(zhuǎn)錄組的空間，獨(dú)立于分子亞群之外，大部分AEL樣本表現(xiàn)出獨(dú)特的圖譜，不同于非m6 AML和骨髓增生異常綜合征樣本。值得注意的是，超過(guò)25%的AEL患者，包括在基因不明確的亞組中，顯示了關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的異常表達(dá)，包括SKI、ERG和ETO2。這些因子在小鼠紅系祖細(xì)胞中的異位表達(dá)阻斷了體外紅系分化并導(dǎo)致永生化，進(jìn)而導(dǎo)致GATA1結(jié)合位點(diǎn)染色質(zhì)可及性降低和對(duì)GATA1活性的功能干擾。體內(nèi)模型顯示了致命紅血球、混合紅血球/髓系或其他惡性腫瘤的發(fā)展，取決于表達(dá)ael相關(guān)改變的細(xì)胞群?？偟膩?lái)說(shuō)，我們的數(shù)據(jù)表明，AEL是一種具有紅細(xì)胞特性的分子異質(zhì)性疾病，其部分原因是造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞中關(guān)鍵的紅細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的異?；顒?dòng)。

技術(shù)路線：

背景：
     紅系的急性髓系白血病(AML)(紅細(xì)胞白血病，AML- m6或AEL)占AML患者的3-5%，與不良預(yù)后有內(nèi)在聯(lián)系。雖然AEL可以發(fā)生在任何年齡，但大多數(shù)患者都是65歲，該病通常繼發(fā)于其他腫瘤，包括骨髓增生腫瘤(MPN)或骨髓增生異常綜合征(MDS)，或在細(xì)胞毒性癌癥治療后發(fā)生。兩種主要的形態(tài)學(xué)亞型已被提出:純紅白血病(PEL, AML-M6b，又稱Di Giuglielmo病)，80%的細(xì)胞屬于紅系;以及AML- M6a，其特征是紅細(xì)胞前體和髓細(xì)胞同時(shí)存在。2016年世衛(wèi)組織分型將AML- m6a納入骨髓增生異常綜合征(MDS)或非特異性AML (AML- nos)，但該分型仍存在爭(zhēng)議。
     功能研究表明，在HSPC預(yù)先發(fā)生改變的背景下，2-5個(gè)基因驅(qū)動(dòng)病變可能足以誘發(fā)AML。對(duì)于AEL，早期的工作表明白血病細(xì)胞通常有復(fù)雜的核型，并且靶向DNA測(cè)序揭示了幾個(gè)已知的aml相關(guān)突變的存在，但是AEL驅(qū)動(dòng)的分子機(jī)制仍然不完全了解，并且紅血病特異性突變很少得到功能上的驗(yàn)證。引人注目的是，單個(gè)或多個(gè)TP53突變已被證明是PEL的分子特征。
     正常的紅細(xì)胞分化是由兩種外部信號(hào)因子控制的，包括通過(guò)EPOR信號(hào)通路介導(dǎo)其作用的促紅細(xì)胞生成素(EPO)和內(nèi)在的多聚體轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。后者包括造血主監(jiān)管機(jī)構(gòu)如GATA-binding蛋白1 (GATA1), t細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病蛋白1 (TAL1), LIM領(lǐng)域僅2 (LMO2) CBFA2 / RUNX1伙伴轉(zhuǎn)錄體若3 (CBFA2T3,也稱為ETO2)和LIM-domain-binding蛋白1 (LDB1),此后一般叫“GATA1-復(fù)合物”,可以激活或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。這些GATA復(fù)合物通過(guò)與重要紅細(xì)胞基因(如血紅蛋白)的基因位點(diǎn)結(jié)合和轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)終末紅細(xì)胞的分化。
結(jié)果：
一、AEL患者的分子改變

     我們收集了58例AEL患者的樣本，包括34例60歲的成人，14例40-59歲，8例青壯年(21-39歲)和2例兒科患者。根據(jù)2008年世衛(wèi)組織分類(lèi)、33例診斷為新創(chuàng)AEL,包括29 AML-M6a 349和4 AML-M6b, 20名患者被診斷出患有AML-M6a次要MDS / CML, 1 AML-M6b二級(jí)脈絡(luò)叢癌和一個(gè)更精確的診斷缺乏4例(補(bǔ)充圖1 a和補(bǔ)充表3)。
     此后，所有患者都使用了AEL一詞。一些AEL樣本缺乏足夠數(shù)量的活細(xì)胞，通過(guò)異種移植來(lái)擴(kuò)大他們?cè)贜OD。Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl / SzJ (NSG)老鼠。
     這種方法提供了額外的白血病材料分離RNA(7例)和DNA(4例)。從33名患者獲得了測(cè)序材料，并對(duì)11對(duì)白血病和非腫瘤性(來(lái)自同一患者的CD3+或CD19+細(xì)胞)樣本進(jìn)行外顯子組測(cè)序，并對(duì)29個(gè)白血病樣本進(jìn)行rna測(cè)序。
     結(jié)合外顯子組和RNA-seq數(shù)據(jù)，我們?cè)?2個(gè)基因中鑒定了序列變異，預(yù)測(cè)了359個(gè)功能后果。
     出現(xiàn)TP53突變的亞群-1(占36.3%的患者)每個(gè)樣本平均有4.41個(gè)突變，與較高的細(xì)胞遺傳風(fēng)險(xiǎn)和較差的結(jié)果相關(guān)。
     亞組3 (n= 10,30.4%)的樣本中沒(méi)有TP53或表觀遺傳變異。平均而言，這些AEL在每個(gè)樣本中顯示1.60個(gè)突變，顯著低于亞組-1和2。
二、AEL基因表達(dá)特征與紅細(xì)胞分化相關(guān)

     由于異質(zhì)遺傳改變不能為這些白血病的紅系表型提供任何強(qiáng)有力的理論依據(jù)，我們通過(guò)比較基因表達(dá)標(biāo)記(GES)來(lái)研究紅系特征。主成分分析(PCA)沒(méi)有顯示GES和之前鑒定的三個(gè)分子亞群之間有任何顯著的相關(guān)性(圖2A)。同樣，診斷時(shí)患者BM中的紅細(xì)胞百分比在GES中反映不佳(圖2B)
     為了進(jìn)一步探討AEL轉(zhuǎn)錄組與人類(lèi)紅細(xì)胞不同成熟階段的關(guān)系，在將人外周血單核細(xì)胞體外分化為集落形成單位紅細(xì)胞(“CFU-E”，CD71+CD235-)、前紅細(xì)胞(“Pro-E”，CD71+CD235low)、中紅細(xì)胞(“Int-E”，CD71+CD235high)和晚期紅細(xì)胞(“l(fā)ate -e”，CD71lowCD235high)后，我們比較了患者的GES和那些通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得的GES并根據(jù)這些成熟階段觀察到聚類(lèi)(圖2C-D)。重要的是，來(lái)自一個(gè)獨(dú)立的更大的AEL患者隊(duì)列36的轉(zhuǎn)錄組相似地聚集在一起(圖2E-F)。
     總之，AEL基因表達(dá)程序受紅細(xì)胞分化階段的影響，而不是受特定基因病變的影響，表明人類(lèi)AEL中紅細(xì)胞的同一性與細(xì)胞起源和驅(qū)動(dòng)細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性有關(guān)。
三、基于轉(zhuǎn)錄組的空間映射AEL, MDS和其他AML到紅系和髓系的譜系軌跡

     我們從DMAP數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索細(xì)胞特征并計(jì)算紅細(xì)胞和髓系分化表達(dá)軌跡(Figure 3A)。與預(yù)期的一樣，相對(duì)差異的基因表達(dá)聚集在我們的AEL樣本之間的紅髓軌跡。大多數(shù)病例(n=25)靠近紅系軸，而其余病例(n=7)靠近髓系軌跡，更接近MDS轉(zhuǎn)錄組(圖3B-C)。同樣，來(lái)自最近發(fā)表的一個(gè)大型AEL組36的樣本，除了MDS樣本(圖3C)和非m6 AML樣本41(圖3D)外，也大多聚集在一起。
     值得注意的是，AEL樣本大多預(yù)測(cè)在造血干細(xì)胞和成熟紅細(xì)胞之間，支持只有部分成熟相關(guān)紅細(xì)胞程序在這些樣本中表達(dá)。有趣的是,在我們AEL樣本映射靠近髓軸和其他AML樣本,樣本# 24顯示高表達(dá)SPI1(圖2圖3 d,補(bǔ)充b)也出現(xiàn)在其他AML亞型和實(shí)際上是由臨床醫(yī)生重新歸類(lèi)為AML-M5獨(dú)立的過(guò)程中。有趣的是，我們觀察到，紅細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子(如KLF1、GATA1、NFE2、TAL1、NFIA)的表達(dá)逐漸下降，并預(yù)測(cè)其活性從紅細(xì)胞向髓系軌跡轉(zhuǎn)移，且與髓系因子(如CEPBA和SPI1)因子呈負(fù)相關(guān)(圖3E和補(bǔ)充圖3C)。我們觀察到一些AEL患者確實(shí)表達(dá)了異常高水平的ERG (n=2)、GFI1 (n=1)、RUNX1T1(=1)和ETO2 (n=1)(圖3F)。
四、AEL相關(guān)的gata1干擾因子過(guò)表達(dá)可轉(zhuǎn)化小鼠紅細(xì)胞祖細(xì)胞

     為了從功能上檢測(cè)在AEL樣本中發(fā)現(xiàn)的gata1干擾因子的異常表達(dá)是否有助于紅細(xì)胞系的轉(zhuǎn)變，我們探討了SKI、ERG、ETO2、GATA1s、EPO、SPI1和B4GALNT3的異位表達(dá)對(duì)小鼠紅細(xì)胞祖細(xì)胞的影響。
     將經(jīng)facs純化的試劑盒+CD71+Ter119+細(xì)胞轉(zhuǎn)染編碼這些基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒，在體外培養(yǎng)(圖4A)。
     只與vector-transduced控制擴(kuò)散~ 7天,ERG的異位表達(dá),SPI1, ETO2,滑雪,和B4GALNT3明顯保持紅細(xì)胞細(xì)胞擴(kuò)散呈現(xiàn)一個(gè)不成熟CD71 +設(shè)備+ Ter119 -表型和pro-erythroblast形態(tài)在30天內(nèi)(圖4圖5 b和補(bǔ)充)。
     雖然在這種情況下，將在人類(lèi)AEL樣本中觀察到的過(guò)表達(dá)水平與在小鼠模型中觀察到的過(guò)表達(dá)水平進(jìn)行精確比較在技術(shù)上具有挑戰(zhàn)性，但在ERG、ETO2、SKI和B4GALNT3中觀察到類(lèi)似的過(guò)表達(dá)范圍(補(bǔ)充圖5B)。值得注意的是，僅EPO或GATA1s的異位表達(dá)不足以使成紅細(xì)胞擴(kuò)張超過(guò)10天(圖4B)。
     為了解決tet2失活和Gata1s突變之間的合作是否能在體外轉(zhuǎn)化成紅細(xì)胞，我們從野生型、Tet2-缺陷(Tet2-/-)、Gata1 e2敲入(Gata1s)和雙Tet2-/-+Gata1s轉(zhuǎn)基因小鼠中純化紅系祖細(xì)胞，比較其增殖情況(圖4C)。只有Gata1s-或Tet2-/-的紅細(xì)胞在10-15天內(nèi)沒(méi)有擴(kuò)張，而Tet2-/-+Gata1s紅細(xì)胞增殖超過(guò)2個(gè)月，呈現(xiàn)紅樣形態(tài)(圖4D和補(bǔ)充圖5C)。
     此外，異常表達(dá)的AEL相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子干擾了GATA1染色質(zhì)的可及性和功能。
五、AEL相關(guān)變化之間的功能協(xié)作的體內(nèi)模型

     為了解決功能合作問(wèn)題，我們將Tet2-/-+Gata1s Lin- HSPC移植到致死輻照受體中(圖5A)。與只接受Tet2-/-細(xì)胞的受體不同，接受Tet2-/-+Gata1s細(xì)胞的受體出現(xiàn)了一種快速、完全滲透的致命疾病，并伴有高WBC、貧血、血小板減少和脾腫大(圖5B-C和補(bǔ)充圖7B)。流式細(xì)胞儀分析顯示，白血病細(xì)胞主要為CD11b+Gr1+髓系細(xì)胞(圖5D)，組織病理學(xué)分析證實(shí)，骨髓和脾臟中有大量髓系細(xì)胞浸潤(rùn)(補(bǔ)充圖7C)。
     我們通過(guò)將從一次受體獲得的純化的ERG轉(zhuǎn)染(GFP+)野生型或TP53R248Q紅母細(xì)胞移植到二次受體，評(píng)估了特別是在紅系祖細(xì)胞中ERG高表達(dá)的長(zhǎng)期后果(圖5E)。
     AEL相關(guān)的TP53改變大多與其他表觀基因組異常有關(guān)，包括轉(zhuǎn)錄因子ERG的異常表達(dá)。所有接受過(guò)表達(dá)ERG的TP53R248Q紅細(xì)胞均發(fā)生致命白血病，中位生存期為60天，而接受表達(dá)ERG的野生型紅細(xì)胞在4個(gè)月后發(fā)生疾病。(圖3F)。
     TP53R248Q+ erg誘導(dǎo)的疾病以貧血、血小板減少(圖5G)、CD71+Ter119+紅血球和少量CD11b+Gr1+髓系祖細(xì)胞在BM中積累為特征(圖5H)，并浸潤(rùn)脾臟和肝臟(補(bǔ)充圖7F)。
六、SKI表達(dá)異常引起紅細(xì)胞轉(zhuǎn)化的體內(nèi)建模

     為了研究SKI的轉(zhuǎn)化活性是否依賴于造血靶細(xì)胞，我們純化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和移植了長(zhǎng)期的多能造血干細(xì)胞、紅細(xì)胞- nriched (MEP)或骨髓承諾粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞(GMP)祖細(xì)胞(圖6A)。移植后3周，所有組的血液中都能檢測(cè)到轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，但僅在ski -轉(zhuǎn)導(dǎo)的HSC和MEP受體的骨髓移植中觀察到。隨后出現(xiàn)以貧血、血小板減少為特征的癥狀性疾病(補(bǔ)充圖8H)，同時(shí)表現(xiàn)為CD11b+Gr1+髓系和CD71+Ter119+紅系特征(圖6B-E)。ski -介導(dǎo)的GMP受體沒(méi)有發(fā)生疾病。有癥狀的HSC或MEP受體顯示嗜堿性、嗜多色和原色紅細(xì)胞增多，網(wǎng)織紅細(xì)胞增多，成熟紅細(xì)胞相對(duì)減少(圖6F)，表明SKI延遲但不完全阻止體內(nèi)紅細(xì)胞分化。組織病理學(xué)分析證實(shí)了BM細(xì)胞過(guò)度增生，并顯示在脾臟和肝臟中有紅細(xì)胞浸潤(rùn)(圖6G和補(bǔ)充8I)。