缺氧調(diào)控鐵死亡

    細(xì)胞鐵對于維持多種代謝途徑至關(guān)重要，而過量的游離鐵可能導(dǎo)致氧化損傷或激起細(xì)胞死亡。低氧原代人巨噬細(xì)胞內(nèi)的游離鐵減少和鐵蛋白表達(dá)增加，包括線粒體鐵蛋白（FTMT），以存儲鐵。缺氧與鐵死亡的關(guān)系吸引學(xué)者們的關(guān)注。
參考文獻(xiàn)：

文章思路：

結(jié)果：
1. 缺氧條件下巨噬細(xì)胞的鐵處理
    探索缺氧對鐵穩(wěn)態(tài)的影響， 缺氧16小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi)鐵減少，而上清液中的鐵略有增加。巨噬細(xì)胞獲得了低氧條件下的鐵輸出表型。二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（DMT1）和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR）參與鐵的輸入。缺氧細(xì)胞中DMT1 mRNA表達(dá)保持不變，TfR mRNA下降，鐵輸出基因銅藍(lán)蛋白（CP）和FPN顯著增加，這些表明缺氧時(shí)細(xì)胞內(nèi)鐵減少。鐵蛋白重鏈（FTH）和輕鏈（FTL）mRNA表達(dá)增加，線粒體鐵蛋白（FTMT）和載鐵蛋白PCBP1的mRNA未改變，NCOA4的mRNA表達(dá)迅速下降。

2. 低氧條件下鐵蛋白自噬降低
    NCOA4參與鐵蛋白的降解，我們分析了FTH、FTL、FTMT的蛋白質(zhì)水平（圖2B-D）。所有鐵蛋白亞型均增加，敲低NCOA4可大大增強(qiáng)FTH和FTMT蛋白的表達(dá)，而未明顯誘導(dǎo)FTL。鐵輸出增強(qiáng)與鐵蛋白穩(wěn)定相關(guān)的鐵輸入減少可能表明巨噬細(xì)胞利用這一機(jī)制減少細(xì)胞內(nèi)低氧鐵池，以減少氧化還原應(yīng)激。                                                        

3. NCOA4介導(dǎo)FTMT在缺氧條件下的降解
    探索NCOA4調(diào)控。在缺氧條件下NCOA4 mRNA降低，只有JNK抑制劑SP600125和PI3K抑制劑LY294002挽救這一下降。在常氧下抑制JNK也增加了NCOA4 mRNA的表達(dá)，認(rèn)為JNK對NCOA4的負(fù)調(diào)控作用。染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）分析發(fā)現(xiàn)缺氧條件下，與NCOA4基因結(jié)合的Pol II豐度顯著降低，說明NCOA4的轉(zhuǎn)錄對缺氧敏感。總之，抑制新生NCOA4 mRNA的合成并結(jié)合JNK依賴性的降低可能是缺氧狀態(tài)下NCOA4水平快速下降的原因。
    JNK可增加幾個(gè)靶基因的轉(zhuǎn)錄，還可以增強(qiáng)micro RNA（miR）表達(dá)。預(yù)測靶向NCOA4的miR，miR-6862-5p是候選對象。阻斷JNK顯著減少miR-682-5p，拮抗miR-6862-5p在常氧和缺氧下顯著增加NCOA4 mRNA。這些表明JNK為miR-6862-5p的調(diào)節(jié)劑，并驗(yàn)證了NCOA4和THBD作為人類巨噬細(xì)胞中miR-6862-5p的新型靶標(biāo)。
    常氧下的FTMT或FTH表達(dá)不受JNK抑制劑影響，低氧下FTMT的增加被逆轉(zhuǎn)。在缺氧條件下，只有FTMT受NCOA4的調(diào)節(jié)。在常氧條件下，SP600125對FTMT的表達(dá)沒有影響，而NCOA4的敲低則使FTMT蛋白表達(dá)增加到缺氧條件下的水平。在缺氧條件下，SP600125降低了NCOA4蛋白量，而同時(shí)抑制NCOA4和阻斷JNK可以恢復(fù)缺氧條件下的FTMT豐度。抑制鐵蛋白自噬是缺氧狀態(tài)下增加FTMT表達(dá)的必要因素。

4. 巨噬細(xì)胞的鐵死亡
    探索FTMT和FTH的表達(dá)與GPX4抑制劑和鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL-3的聯(lián)系。RSL-3與Liproxstatin1(Lip)聯(lián)合使用，已知可防止脂質(zhì)過氧化，從而抑制鐵死亡?？紤]到鐵蛋白的顯著增加及其在細(xì)胞凋亡過程中的保護(hù)功能，檢測了RSL-3處理后巨噬細(xì)胞的活力。在不存在或存在Liproxstatin-1的情況下用RSL-3處理的細(xì)胞活力無明顯變化，MDA的形成保持不變。敲低FTMT或兩種鐵蛋白RSL-3都能降低常氧下的細(xì)胞活力，在低氧條件下降低FTMT并不允許RSL-3降低細(xì)胞活力。缺氧條件下，Liproxstatin-1可逆轉(zhuǎn)RSL-3處理的siFTMT/FTH細(xì)胞活力的降低。在常氧條件下，siFTMT/FTH細(xì)胞中RSL-3細(xì)胞活力的降低不受Liproxstatin-1的影響。這些表明，在缺氧條件下兩種鐵蛋白都具有保護(hù)作用，這與RSL-3處理對FTMT和FTH的顯著誘導(dǎo)一致。在巨噬細(xì)胞中，JNK作用于miR-6862-5p以降解NCOA4 mRNA。缺氧會降低NCOA4 mRNA的轉(zhuǎn)錄，這些聯(lián)合作用降低了NCOA4的蛋白質(zhì)含量。

5. 腫瘤細(xì)胞顯示高NCOA4但低FTMT表達(dá)譜
    在巨噬細(xì)胞中，通過NCOA4和鐵蛋白可防止缺氧時(shí)的鐵死亡。HT1080細(xì)胞 NCOA4的常氧水平較巨噬細(xì)胞高，在缺氧狀態(tài)下并未下調(diào)NCOA4。敲低HT1080細(xì)胞中的NCOA4，引起FTMT和FTH的增加，表明NCOA4調(diào)節(jié)兩種蛋白質(zhì)。與巨噬細(xì)胞相反，在HT1080細(xì)胞中，F(xiàn)TH和NCOA4均對缺氧不敏感。巨噬細(xì)胞在缺氧條件下降低NCOA4從而降低鐵蛋白自噬，從而增加FTMT。因此，HT1080細(xì)胞在缺氧條件下失去增加FTMT蛋白的能力。
    在低氧巨噬細(xì)胞中，F(xiàn)TMT或FTH足以保護(hù)其免受鐵死亡。由于HT1080細(xì)胞表達(dá)FTH，只有低水平的FTMT。探索在低氧條件下FTH是否能保護(hù)細(xì)胞免受鐵死亡作用。缺氧HT1080細(xì)胞在條件下孵育20h，用RSL-3加/不加Liproxstatin-1處理。RSL-3處理的細(xì)胞失去了成纖維細(xì)胞的形狀，變得圓形，可被Liproxstatin-1抑制。缺氧細(xì)胞中FTH的表達(dá)，顯著增加，不受RSL-3或Liproxstatin-1的影響。RSL-3可使HT1080的活力降低約50%，Liproxstatin-1可完全補(bǔ)償該作用。缺氧細(xì)胞活力僅降低約25%，這也是由于鐵死亡。在常氧條件下敲低FTH降低了細(xì)胞活力，加入RSL-3并沒有進(jìn)一步降低細(xì)胞活力。在巨噬細(xì)胞中缺氧降低了NCOA4，從而增加了FTMT和FTH的水平，可保護(hù)HT1080細(xì)胞免受鐵死亡。