膽固醇與非酒精性脂肪肝相關肝癌

    非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）相關的肝細胞癌（HCC）是世界范圍內日益增加的醫(yī)療負擔。飲食中膽固醇對NASH進展的作用已有報道，且腸道菌群有助于NAFLD的發(fā)生及其向NAFLD-HCC的發(fā)展。然而，腸道微生物群失調是否是飲食膽固醇誘導的NASH和NAFLD-HCC進展的原因或影響尚不清楚。今天小編為大家?guī)戆l(fā)表于影響因子為19.819的“Gut”上的文章“Dietary cholesterol drives fatty liver- associated liver cancer by modulating gut microbiota and metabolites”，為大家介紹膽固醇在NAFLD-HCC發(fā)生發(fā)展中的作用和機制。

    在本文中，我們以高脂/高膽固醇（HFHC）、高脂/低膽固醇或普通飼料喂養(yǎng)C57BL/6雄性幼仔14個月。將降膽固醇藥物阿托伐他汀應用于HFHC喂養(yǎng)的小鼠。將不同飲食的小鼠糞便移植到無菌小鼠中，以確定膽固醇調節(jié)微生物群在NAFLD-HCC中的直接作用。此外，我們采用16S rRNA測序分析腸道菌群，液相色譜-質譜代謝組學（LC-MS）分析血清代謝物。
技術路線:

結果：
1.膽固醇促進NAFLD-HCC的發(fā)展
    為了研究膽固醇在脂肪變性、NASH、纖維化和NAFLD-HCC中的作用，用HFHC、17-HFLC或NC喂養(yǎng)小鼠。在不同時間點（3、8、10、12和14個月）監(jiān)測血清甲胎蛋白（AFP，肝癌標志物）水平。在第10個月觀察到AFP水平升高，與第14個月HFLC或NC相比，喂食HFHC的小鼠在第12個月和第14個月進一步升高（圖1A）。MRI掃描顯示，在第14個月時，喂食HFHC的小鼠出現(xiàn)肝臟腫瘤（圖1B）。然后在第14個月收獲小鼠。在喂食HFHC的小鼠中，有68%出現(xiàn)肝腫瘤，但在喂食HFLC或NC飲食的小鼠中未發(fā)現(xiàn)肝腫瘤（圖1C）。肝切片組織學檢查證實所有肝腫瘤均為HCC（圖1C），與喂食HFLC的小鼠相比，喂食HFHC小鼠的肝臟切片中有更多的Ki-67陽性細胞，這表明喂食HFHC小鼠的細胞增殖增加（圖1C）。這些結果表明，飲食膽固醇可以自發(fā)地誘導NAFLD-HCC的形成。隨著HCC的形成，在第14個月時，與NC喂養(yǎng)的小鼠相比，喂食HFHC的小鼠體重、內臟脂肪、肝臟重量和肝體重比顯著增加（圖1D）。HFLC喂養(yǎng)的小鼠體重、內臟脂肪和肝臟重量也有所增加（圖1D）。與HFLC喂養(yǎng)或NC喂養(yǎng)小鼠相比，HFHC喂養(yǎng)小鼠的血清膽固醇、肝臟游離膽固醇和膽固醇酯、葡萄糖不耐受和空腹胰島素顯著增加（圖1E）。與NC相比，HFLC喂養(yǎng)的小鼠的葡萄糖耐量和空腹胰島素也有所增加（圖1E）。

2.高膽固醇喂養(yǎng)14個月的小鼠出現(xiàn)NASH和纖維化
    肝臟切片檢查顯示，在喂食了HFHC 14個月的小鼠的HCC相鄰肝組織和非HCC肝組織中存在以脂肪變性和小葉炎癥為特征的脂肪性肝炎，而在HFLC喂養(yǎng)的小鼠中只觀察到脂肪變性（圖2A）。與組織學炎癥相一致的是，與HFLC或NC喂養(yǎng)的小鼠相比，HFHC喂養(yǎng)的小鼠血清丙氨酸轉氨酶（ALT）和天門冬氨酸轉氨酶（AST）水平顯著升高(圖2B)。通過細胞因子譜分析和酶聯(lián)免疫吸附測定，在HFHC喂養(yǎng)的小鼠中，細胞因子包括IL-6、IL-1α和IL-1β（圖2C，D）增加。RNA測序分析表明，與HFLC喂養(yǎng)小鼠相比，14個月HFHC喂養(yǎng)小鼠的肝組織中關鍵的NASH相關促炎細胞因子，包括Cx3cl1、Mcp1、Cxcl10、Mip1β、Mip1α、Ccl5、Cxcl16和Tnfα顯著上調（圖2D）。HFHC喂養(yǎng)的小鼠出現(xiàn)嚴重的纖維化損傷，膠原分布區(qū)明顯增多α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）mRNA和蛋白水平增加（圖2E），肝羥脯氨酸試驗（圖2F）顯示膠原含量增加（圖2E）。肝臟氧化應激檢查顯示，在HFHC喂養(yǎng)的小鼠中，氧化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）與NADH（NAD的還原形式）的比率和抗氧化超氧化物歧化酶（SOD）活性顯著降低（圖2G），表明膽固醇誘導肝氧化應激?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明在HFHC喂養(yǎng)的小鼠的非HCC肝組織中形成了NASH和纖維化。

3.高膽固醇導致小鼠脂肪肝、脂肪性肝炎和纖維化
    為了闡明肝細胞癌形成前NAFLD的進展，我們監(jiān)測了喂飼HFHC的小鼠血清AFP和肝臟組織學變化。在喂養(yǎng)后3、8、10和12個月收獲小鼠（圖3A）。喂食HFHC小鼠的肝臟組織學在3個月時顯示脂肪變性和輕度炎癥，8個月時出現(xiàn)脂肪性肝炎和纖維化并在10、12和14個月時形成HCC（圖3B）。我們還對兩個HCC標志物AFP和GP73進行了免疫組化。在喂食HFHC的小鼠的肝組織上觀察到陽性染色（圖3B）。肝臟脂肪變性、小葉炎癥和肝膠原區(qū)域的評分證實了整個疾病階段肝臟組織學嚴重程度的增加（圖3B）。此外，10%的HFHC喂養(yǎng)小鼠在10個月時發(fā)生HCC，25%在12個月時發(fā)展成HCC，68%在14個月時發(fā)展成HCC（圖3C），表明HFHC喂養(yǎng)的小鼠逐漸發(fā)展成脂肪變性、脂肪性肝炎、纖維化和NAFLD-HCC。

4.膽固醇誘導的腸道菌群失調在NAFLD-HCC的發(fā)生和發(fā)展中的作用
    為了探討腸道微生物群在調節(jié)膽固醇誘導的NAFLD-HCC中的潛在作用，我們對14個月齡的HFLC和HFHC喂養(yǎng)小鼠的糞便進行了16S rRNA基因測序。PCA分析表明14個月齡時HFLC喂養(yǎng)和HFHC喂養(yǎng)小鼠的腸道微生物群組成存在差異（p<0.001）（圖4A）。此外，在14個月齡時，與單純脂肪變性的HFLC喂養(yǎng)小鼠相比，HFHC喂養(yǎng)的HCC小鼠的細菌多樣性更低，細菌豐富度增加（圖4A）。與HFLC喂養(yǎng)的小鼠相比，喂食HFHC的小鼠中有幾種細菌OTU的豐度不同（圖4B）。主成分和冗余分析還表明，喂食HFHC 3個月，8個月和14個月的小鼠的微生物群組成明顯聚集（圖4C）。此外，細菌豐富度隨著NAFLD–HCC的進展而依次增加（圖4D）。特別是，觀察到Mucispirillum schaedleri_Otu038、Desulfovibrio_Otu047, Anaerotruncus_Otu107 and Desulfovibrionaceae_Otu073從喂養(yǎng)HFHC的3個月到8個月和14個月依次增加（圖4D）。此外，與HFLC喂養(yǎng)的小鼠相比，喂養(yǎng)HFHC的小鼠腸道微生物群相關的色氨酸代謝能力降低（圖4E）。綜上所述，高膽固醇飲食導致腸道微生物群失調和微生物色氨酸代謝受損。
接著進行相關分析以確定細菌豐度與小鼠表型的潛在關聯(lián)。我們觀察到，在HFHC喂養(yǎng)小鼠的糞便樣本中富集的M. schaedleri_Otu038，Desulfovibrio_Otu047，Anaerotruncus_Otu107，C celatum_Otu070，C. cocelatum_Otu036 和 C. methylpentosum_Otu053呈正相關（圖4F），而Bifidobacterium_Otu026，B. acidifaciens_Otu032，B. uniformis_Otu080，A. municiphila_Otu034 和Lactobacillus_Otu009在HFHC喂養(yǎng)的小鼠中被耗盡，與高膽固醇飲食、血清和肝臟膽固醇水平呈負相關（圖4F）。這些結果表明，NAFLD-HCC患者腸道菌群失調與膽固醇水平相關。另外，雙歧桿菌和類桿菌與血清總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇呈負相關，而與高密度脂蛋白膽固醇呈正相關（圖4G），進一步表明腸道微生物群參與了膽固醇誘導的紊亂。

5.膽固醇通過誘導代謝物改變促進NASH-HCC的進展
    為了揭示可能與膽固醇誘導的NAFLD-HCC相關的代謝表型，我們對HFHC喂養(yǎng)和HFLC喂養(yǎng)小鼠的血清進行了代謝分析。根據(jù)PCA測定，血清代謝物有顯著差異（圖5A）。膽汁酸生物合成是高膽固醇小鼠的關鍵途徑（圖5B）。初級膽汁酸包括?；悄懰幔═CA）、?；侨パ跄懰幔═UDCA）、甘膽酸（GCA）和牛磺去氧膽酸（TCDCA）是HFHC喂養(yǎng)小鼠中異常上調的代謝物。另一方面，微生物色氨酸代謝產(chǎn)物 IPA 18在HFHC喂養(yǎng)的小鼠中是一個異常的下調代謝產(chǎn)物（圖5C）。此外，與HFLC喂養(yǎng)的小鼠相比，HFHC喂養(yǎng)的小鼠門靜脈的血清脂多糖（LPS）濃度升高，結腸E-鈣粘蛋白表達減少（圖5D），表明膽固醇可能損害腸屏障功能。接著進行相關分析以確定HFHC改變的微生物和代謝物之間的潛在聯(lián)系。相關分析顯示，Mucispirillum schaedleri_Otu038與TUDCA、TCDCA、TCA和GCA呈正相關。Roseburia_Otu056 and Helicobacter_ganmanii_Otu031也與TUDCA和TCDCA呈正相關。此外，HFHC-耗盡的Akkermancia_muciniphila_Otu034與TCDCA和TUDCA呈負相關，而HFHC-富集的Anaerotruncus_Otu107與IPA呈負相關（圖5E）。
    進一步的實驗表明，高膽固醇飲食不會改變膽汁酸合成酶的mRNA表達，包括肝細胞色素P450（Cyp）7a1、Cyp8b1、Cyp27a1和Cyp7b1（圖5F）。其他體外實驗表明，TCA可加重膽固醇誘導的人永生化肝細胞系LO2（圖5G）中的甘油三酯積累，而IPA抑制NASH-HCC細胞系、HKCI-2和HKCI-10中膽固醇誘導的脂質積聚（圖5G）和細胞增殖（圖5H）。這些結果表明，膽固醇通過調節(jié)宿主血清代謝物，至少部分通過增加TCA和降低IPA來促進NASH-HCC的進展。

6.高膽固醇調節(jié)腸道微生物群促進無菌小鼠脂肪性肝炎和肝細胞增殖
    我們通過糞便微生物群移植（FMT）評估膽固醇調節(jié)微生物群在NAFLD–HCC中的作用。將NC喂養(yǎng)、HFLC喂養(yǎng)和HFHC喂養(yǎng)小鼠（14個月）的糞便灌胃給NC飲食下的無菌小鼠（G-NC、G-HFLC和G-HFHC）（圖6A）。在FMT后8個月、10個月和14個月，G-HFHC小鼠的肝臟脂質積聚和過氧化作用顯著增加，并伴有肝組織學損害（圖6B）。通過細胞因子譜分析，肝臟細胞因子和趨化因子包括IL-6增強，證明炎癥增加（圖6C）。
    在14個月齡時，G-HFHC小鼠的肝臟中觀察到肝細胞增殖增加（圖6D）。癌癥途徑PCR陣列顯示，與G-NC和G-HFLC小鼠相比，G-HFHC小鼠肝組織中參與致癌途徑的基因上調，包括細胞增殖（Cdc20）、血管生成（Pgf）、侵襲/轉移（Serpinb2、Snai3）和凋亡相關基因（Fasl和Lpl）下調（圖6E1）。免疫印跡證實CDC20上調（圖6E2）。在14個月齡的G-HFHC小鼠中觀察到一個肝結節(jié)，（圖6A）。組織學檢查證實該結節(jié)發(fā)育不全，有小球狀增生，細胞增殖增強（圖6A）。此外，我們發(fā)現(xiàn)，受體無菌小鼠的腸道菌群與供體的飲食有顯著差異（圖6F）。對無菌小鼠血清代謝物的分析表明，與G-HFLC小鼠相比，G-HFHC小鼠的IPA降低，與喂食HFHC的傳統(tǒng)小鼠一致（圖6G）?？傊@些數(shù)據(jù)表明，膽固醇調節(jié)的微生物群通過誘導代謝物改變促進NAFLD和肝細胞增殖，從而促進膽固醇誘導的NAFLD-HCC的形成。

7.抗膽固醇治療可完全預防HFHC喂養(yǎng)小鼠NAFLD–HCC的形成
    由于膽固醇推動NAFLD–HCC的進展，我們評估了抗膽固醇藥物是否可以抑制NAFLD及其進展為HCC。阿托伐他?。?0mg/kg）是一種降低膽固醇的藥物，給予喂食了7個月的HFHC的小鼠，之后并繼續(xù)服用HFHC和阿托伐他汀7個月（圖7A）。在實驗結束時（14個月），阿托伐他汀完全阻止了HFHC飲食誘導的NAFLD-HCC形成，并改善了NASH的嚴重程度（圖7B）。這與血清膽固醇、肝臟游離膽固醇、血清甲胎蛋白（圖7C）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、血清促炎細胞因子和氧化應激的降低相伴隨（圖7D）。阿托伐他汀還通過顯著減少肝膠原沉積和羥脯氨酸含量來改善肝纖維化（圖7E）。用16S rRNA基因測序法對阿托伐他?。℉FHC+At）處理的HFHC小鼠糞便進行微生物群落分析，并與NC、HFLC和HFHC喂養(yǎng)的小鼠進行比較。抗膽固醇阿托伐他汀治療顯著恢復了HFHC喂養(yǎng)小鼠的細菌豐富度（圖7F）。此外，在HFHC喂養(yǎng)小鼠失調的OTUs中（圖4B和D），抗膽固醇治療可逆轉Mucispirillum schaedleri_Otu038，Desulfovibrio_Otu047，Anaerotruncus_Otu107 和Desulfovibrionaceae_Otu073的豐度（圖7F）。為了研究微生物群在抗膽固醇藥物預防NAFLD肝細胞癌中的直接作用，我們將HFHC+At小鼠的糞便灌胃給無菌小鼠。在灌胃14個月后，與G-HFHC組相比，G-HFHCAt小鼠的肝臟組織學得到改善，肝臟甘油三酯和脂質過氧化減少（圖7G）。這些結果進一步表明腸道微生物群在膽固醇誘導的NAFLD-HCC中起著積極的調節(jié)作用。

結論：
    總之，這項研究首次表明，長期高膽固醇飲食通過調節(jié)腸道微生物群，誘導雄性小鼠自發(fā)性和漸進性NAFLD-HCC的發(fā)展。膽固醇通過腸道微生物群的改變誘導TCA增加和IPA降低，從而促進肝臟中的脂質積累和細胞增殖，導致NAFLD–HCC的發(fā)展。抗膽固醇治療完全消除了膽固醇引起的NAFLD-HCC的形成。這項研究強調膽固醇抑制和腸道微生物群及其相關代謝物的控制可能是預防NAFLD-HCC的有效策略。