miRNA與散發(fā)性克雅氏病的血液診斷

    散發(fā)性克雅氏病(sCJD)表現(xiàn)為一種傳染性的，快速進行性癡呆，生存期短。代表性的病理特征是腦灰質(zhì)海綿狀變化,并伴有異常形式的朊病毒蛋白(PrP)的沉積。腦核磁共振成像(MRI)和腦脊液(CSF)分析是常用的診斷方法。目前，還沒有用于診斷或疾病監(jiān)測的臨床血液檢測。miRNAs（microRNAs）,可以抑制目標mRNA轉(zhuǎn)錄本的翻譯并標記其降解。miRNA的失調(diào)已在疾病狀態(tài)中被廣泛描述。近期發(fā)表Nature Communications（IF=12.121）上的文章分析了sCJD中血液miRNA的表達，并評價了其作為sCJD診斷的價值。
技術(shù)路線圖：

研究結(jié)果：
1.在sCJD血液中，小RNA測序鑒定5個差異表達miRNAs（DE miRNAs）
    病例對照研究57例sCJD患者和48例對照組的血液(表1)。測量了所有樣本中的miRNAs。圖1a顯示,四個microRNA有統(tǒng)計上顯著變化。圖1b顯示，與健康對照相比，sCJD中hsa-miR-16-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-106b-3p和hsalet-7i-5p下調(diào)，包括hsa-let-7d-3p。使用這五種差異表達的miRNA進行的無監(jiān)督層次聚類分析產(chǎn)生了兩個主要的樣本聚類，大多數(shù)健康個體緊密地聚類在一起(圖1c)。

2.sCJD 差異表達在獨立隊列中復(fù)制
    使用獨立隊列和技術(shù)驗證和重復(fù)這些結(jié)果。重復(fù)隊列包括29名sCJD患者和30名健康 (表1)。RT-qPCR檢測顯示sCJD血液中hsa-let-7i-5p、hsa-miR-16-5p和hsa-miR-93-5p水平較低，而hsa-miR-484如預(yù)期保持不變(圖2a)，與上述研究結(jié)果一致。在其余兩種被檢測的miRNA中，hsa-miR-106b-3p沒有擴增，而hsa-let-7d-3p與上述結(jié)果不相符(圖2a)。
    我們推測，如果差異miRNA表達在sCJD的外周病理生理中發(fā)揮作用，那么sCJD血液中的相關(guān)mRNA靶點也應(yīng)該發(fā)生改變。我們使用TarBase鑒定這些mRNA靶點(使用熒光素酶分析和/或免疫沉淀驗證);RT-qPCR檢測重復(fù)隊列中報道的由hsa-let-7i-5p、hsa-miR-16-5p和hsamiR-93-5p控制的6個轉(zhuǎn)錄本的表達:CCND3、VEGFA、NAP1L1、ZFP36、CDKN1A和RNF44。圖2b顯示，與對照組的血液相比，sCJD患者的血樣中有四個轉(zhuǎn)錄本水平升高，這與沉默miRNA之后靶mRNA的表達升高是一致的。對差異表達(DE)microRNA的六個靶點進行通路富集分析發(fā)現(xiàn)沒有顯著的富集。這些結(jié)果表明sCJD血液中hsa-let-7i-5p、hsa-miR-16-5p和hsamiR-93-5p表達下調(diào)，同時其所對應(yīng)的mRNA靶蛋白水平升高。

3.sCJD中，let-7i、miR-16和miR-93下調(diào)具有特異性
    為了進一步研究這種基于血液的miRNA標簽與sCJD的相關(guān)性，我們分析AD患者的血液 (相當于sCJD患者第一次取樣) 中hsa-let-7i-5p、hsa-miR-16-5p和hsa-miR-93-5p的水平。30個 AD患者的性別和年齡與對照組匹配用于復(fù)制分析(表1)。RT-qPCR數(shù)據(jù)表明，與sCJD形成鮮明對比,hsa-let-7i-5p, hsa-miR-16-5p和hsa- mir-93-5p在AD患者中升高（圖3）。這些結(jié)果表明，血液中hsa-let-7i-5p、hsa-miR-16-5p和hsa-miR-93-5p的水平建立了一個標準，可以區(qū)分健康對照、AD和sCJD。

4.對sCJD血液中DE miRNA表達的縱向評價
    雖然疾病指標和DE miRNAs之間沒有代表性的相關(guān)性，但我們猜想是否miRNA表達下降的速度與sCJD患者中觀察到的下降速度有關(guān)。高的個體間變異可能會模糊隨著時間的推移個體內(nèi)的縱向影響。從21個sCJD個體縱向收集了50份血液(MRC朊病毒疾病評級量表評估每位患者的病情，以便監(jiān)測疾病進展情況)。RT-qPCR檢測的hsa-let-7i-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-93-5p和hsa-miR-484（sCJD血液中未發(fā)生變化）的表達水平，并將其轉(zhuǎn)化為表達下降率。圖4a-d顯示，hsa-let-7i-5p、hsa-miR- 16-5p和hsa-miR-93-5p水平的下降率與疾病進展率(每天功能損失%)無關(guān)。

5. miRNA標記的診斷潛力
    為了評估m(xù)iRNAs區(qū)分sCJD病例和健康對照的能力，進行了ROC分析。
    比較sCJD和健康對照，曲線下面積(AUCs)范圍從0.736 (has-let-7i-5p)到0.762 (hsa-miR-16-5p)，當三種miRNA合并時，曲線下面積(AUCs)達到0.788(圖5a);在復(fù)制集中采用相同的方法，三種miRNAs聚合后的表現(xiàn)均優(yōu)于各自的表現(xiàn)(圖5b)。我們發(fā)現(xiàn)hsa-let-7i-5p, hsa-miR-16-5p和hsa-miR-93-5p是在AD患者中表達上調(diào)(相反，在sCJD中表達下調(diào))，接下來我們分別使用這三種miRNA并將其聚合，進行了同樣的分析(即將AD與健康對照進行比較)。圖5c顯示，三種miRNA的曲線下面積(AUC)值在0.810 (hsa-miR-93-5p)到0.859 (hsa-miR-16- 5p)之間，三種miRNA的曲線下面積(AUC)之和達到0.860，具有較好的診斷鑒別性。最后，由于缺乏在血液中特異性和選擇性地區(qū)分sCJD患者和AD患者的生物標志物，我們計算了sCJD和AD的AUCs比較。值得注意的是，曲線下面積(AUC)的范圍為0.897 (hsa-miR-93-5p)至0.934 (hsa-let-7i-5p)。將這3個miRNA結(jié)合，曲線下面積(AUC)值為0.924，特異性為100%(圖5d)。，這些結(jié)果表明，這些血液miRNA表達標記可用于區(qū)分AD和健康對照，sCJD和AD

總結(jié)：
    最后，miRNA在鑒別sCJD和阿爾茨海默病中顯示了較高的準確性。這些發(fā)現(xiàn)突出了sCJD外周的分子改變，為鑒別診斷提供了信息，并提高了對人類朊病毒疾病機制的理解