CircCDK14，骨關(guān)節(jié)炎緩和因子

    骨關(guān)節(jié)炎（OA）是一種慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，最常見于老年人，是世界范圍內(nèi)致殘的主要原因。大量的危險(xiǎn)因素已被證明與骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展有關(guān)，包括衰老、性別、肥胖、遺傳、關(guān)節(jié)松弛、肌肉無力和既往的關(guān)節(jié)損傷。盡管骨關(guān)節(jié)炎對(duì)經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的影響越來越大，但對(duì)其發(fā)病機(jī)理的深入了解仍然是難以捉摸的。以往研究表明，circRNA 和miRNA在炎癥緩和中具有重要作用，可能是治療骨關(guān)節(jié)炎的新型研究靶點(diǎn)。近期，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院趙興博士的團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p下調(diào)Smad2的表達(dá)，誘導(dǎo)TGF-β信號(hào)通路障礙，而CircCDK14能夠作為miR-125a-5p的海綿促進(jìn)Smad2的表達(dá)緩和骨關(guān)節(jié)炎，相關(guān)研究結(jié)果以“CircCDK14 protects against Osteoarthritis by sponging miR-125a-5p and promoting the expression of Smad2”為題發(fā)表在Theranostics雜志上，雜志影響因子8.579。
研究思路：
1.根據(jù)測序結(jié)果篩選在骨關(guān)節(jié)炎組織中表達(dá)下調(diào)的circRNA（CircCDK14），并在軟骨細(xì)胞中進(jìn)行表征；
2.探討所選CircCDK14在軟骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）代謝、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡中的作用；
3.研究CircCDK14的ceRNA機(jī)制，以及相關(guān)靶點(diǎn)在骨關(guān)節(jié)炎中的作用；
4.探討CircCDK14/miR-125a-5p/Smad2在兔模型中的作用。
結(jié)果：
1.CircCDK14在骨關(guān)節(jié)炎中的表達(dá)特征
    作者通過之前的測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)CircCDK14在骨關(guān)節(jié)炎組織中顯著下調(diào)（A），進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)15個(gè)人類軟骨樣本中CircCDK14在關(guān)節(jié)承重區(qū)域顯著下調(diào)（B-D）。通過體外培養(yǎng)骨關(guān)節(jié)炎人群的軟骨細(xì)胞，并添加IL-1β、LPS 或TNF-α模擬骨關(guān)節(jié)炎微環(huán)境，發(fā)現(xiàn)在添加IL-1β、LPS 或TNF-α后CircCDK14表達(dá)大幅度減少（E）。作者利用Sanger測序確定了CircCDK14是頭到尾剪接（F），并利用引物確定CircCDK14的環(huán)狀結(jié)構(gòu)（G），且RNA酶 R處理后因其共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)不被降解（H）。熒光原位雜交發(fā)現(xiàn)CircCDK14主要定位于細(xì)胞質(zhì)。以上結(jié)果說明CircCDK14主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，在關(guān)節(jié)承重區(qū)域顯著性低表達(dá)。

2.CircCDK14在軟骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）代謝、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡中的作用
    作者通過siRNA沉默軟骨細(xì)胞中CircCDK14的表達(dá)，并利用WB、qRT-PCR、IF實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CircCDK14沉默能后促進(jìn)MMP3和MMP13的表達(dá)，抑制Sox9和Collagen II的表達(dá)（A-D），且能減弱人類軟骨細(xì)胞增殖（F）。流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)CircCDK14沉默顯著增加了細(xì)胞凋亡的比率（E）。

    通過WB、qRT-PCR、IF實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)CircCDK14能夠抵消用IF-1β處理對(duì)促進(jìn)MMP3和MMP13表達(dá)以及抑制Sox9和Collagen II表達(dá)的影響（A-D），且能使IL-1β處理后降低的增殖能力顯著增強(qiáng)（E）。以上結(jié)果說明CircCDK14通過調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖、凋亡和ECM代謝預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎。

3. 人類軟骨細(xì)胞中CircCDK14與miR-125a-5p的作用機(jī)制
    作者通過qRT- PCR發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，Ago2過表達(dá)組中被Ago2抗體拉下的內(nèi)源性CircCDK14顯著富集（A）。利用targetscan和rnahybrid預(yù)測可能的靶點(diǎn)miRNAs，其中12個(gè)miRNAs被重復(fù)篩選（B），pull-down實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-3137、miR- 1184、miR-125a-5p和miR-3074-5p被拉下來，熒光素酶檢測結(jié)果顯示只有miRNA-125a-5p降低了50%以上的熒光素酶活性（E），進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miRNA-125a-5p過表達(dá)誘導(dǎo)Collagen II和Sox9表達(dá)下降，而MMP3和MMP13的表達(dá)沒有改變（F）。通過構(gòu)建熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p和CircCDK14能夠結(jié)合（G，H），F(xiàn)ISH結(jié)果表明miR-125a-5p主要分布在細(xì)胞質(zhì)中（I）。這些結(jié)果證實(shí)了CircCDK14作為miR-125a-5p海綿發(fā)揮作用。

4. miR-125a-5p在骨關(guān)節(jié)炎中的作用
    作者通過FISH實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p在關(guān)節(jié)承重區(qū)域顯著性高表達(dá)（A），WB、qRT-PCR和IF表明miR-125a-5p過表達(dá)能夠下調(diào)Collagen II和Sox9（B-C），細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明miR-125a-5p的表達(dá)水平與細(xì)胞增殖能力呈負(fù)相關(guān)（D）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p抑制逆轉(zhuǎn)了CircCDK14沉默對(duì)人類軟骨細(xì)胞 ECM合成、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的影響（E-H）。這些結(jié)果表明，miR-125a-5p是CircCDK14的重要下游靶點(diǎn)，同時(shí)在軟骨細(xì)胞中發(fā)揮拮抗CircCDK14的作用。

5. CircCDK14/miR-125a-5p/Smad2軸
    通過Targetscan、Starbase、miRTarBase和MiRwalk預(yù)測軟件篩選了12個(gè)可能的mRNA靶點(diǎn)（A），qRT-PCR結(jié)果顯示DHX33、Smad2 和ATXN7L3在CircCDK14被下調(diào)后表達(dá)下調(diào)（B），其中只有Smad2對(duì)Sox9 和Collagen II有影響（C），且熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明Smad2與miR-125a-5p能夠結(jié)合(D-E)。WB和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CircCDK14沉默和miR-125a-5p過表達(dá)減弱了Smad2的表達(dá)，但miR-125a-5p抑制能夠消除CircCDK14沉默誘導(dǎo)的影響（F-I）。以上結(jié)果說明Smad2是一個(gè)重要的下游靶點(diǎn)。

    作者發(fā)現(xiàn)Smad2在15名人類骨關(guān)節(jié)炎樣本的關(guān)節(jié)承重區(qū)域明顯低表達(dá)（A，B），利用siRNA下調(diào)Smad2的表達(dá)并通過WB、qRT-PCR和IF實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Smad2沉默顯著性降低了軟骨細(xì)胞中Sox9和Collagen II的表達(dá)（C-E），進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Smad2沉默減弱了軟骨細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力（F）。通過WB和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Smad2過表達(dá)能消除CircCDK14沉默或者miR-125a-5p過表達(dá)對(duì)Sox9和Collagen II的影響（H）。綜上所述，我們的結(jié)果顯示Smad2是CircCDK14/miR-125a-5p軸的主要調(diào)節(jié)因子，其在軟骨細(xì)胞中表現(xiàn)出與CircCDK14類似的功能。

6. CircCDK14在體內(nèi)對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的作用
    作者構(gòu)建兔模型探討CircCDK14在體內(nèi)對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的作用，F(xiàn)ISH和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)評(píng)估CircCDK14、miR-125a-5p和Smad2的過表達(dá)水平（A），番紅O和固綠染色顯示注射WT AAV CircCDK14后關(guān)節(jié)表面軟骨層明顯增厚，而miR-125a-5p過表達(dá)減弱了這一影響（B）。免疫組織化學(xué)和WB分析表明注射WT AAV CircCDK14后軟骨細(xì)胞中MMP3和MMP13的表達(dá)下降，Smad2、Sox9和Collagen II的表達(dá)上升；miR-125a-5p過表達(dá)減弱Smad2、Sox9和Collagen II的表達(dá)，而增加了MMP3和MMP13的表達(dá)（C，E）。TUNEL染色實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞凋亡的結(jié)果與體外一致（D）。以上結(jié)果表明CircCDK14通過miR-125a-5p和Smad2的調(diào)節(jié)作用在體內(nèi)行使功能。

結(jié)論：
    CircCDK14可以通過維持軟骨ECM的合成代謝和抑制分解代謝來緩和骨關(guān)節(jié)炎，這一作用是通過CircCDK14/miR-125a-5p/Smad2調(diào)控軸調(diào)控的。

參考文獻(xiàn)：
Panyang Shen, Yute Yang, Gang Liu, et al. CircCDK14 protects against Osteoarthritis by sponging miR-125a-5p and promoting the expression of Smad2. Theranostics. 2020, 10(20): 9113-9131.