Biomaterials|MSC源性外泌體通過NRF2防御系統(tǒng)的適應(yīng)性調(diào)節(jié)保護(hù)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的皮膚損傷

    最近在Biomaterials上線了一篇標(biāo)題為 “MSC-derived exosomes protect against oxidative stress-induced skin injury via adaptive regulation of the NRF2 defense system” 的文章。該文的通訊作者是來自西安交通大學(xué)安市中心醫(yī)院微創(chuàng)神經(jīng)外科與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心的龍乾發(fā)。

    氧化應(yīng)激是紫外線照射和其他損傷性刺激引起皮膚損傷的主要原因。這些刺激可通過促進(jìn)活性氧(ROS)的產(chǎn)生和降低抗氧化酶活性，損害細(xì)胞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和皮膚細(xì)胞的dna，從而導(dǎo)致曬傷、過早衰老和致癌。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是具有多向分化潛能和免疫抑制特性的多能基質(zhì)細(xì)胞。它們可以從多種來源獲得，包括臍帶、骨髓或脂肪組織，這使它們成為一種很有前途的適合免疫調(diào)節(jié)和再生的候選細(xì)胞類型。越來越多的證據(jù)表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡(EVs)通過攜帶大量的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸，在細(xì)胞間通信中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，此外，它還是生物標(biāo)志物的潛在來源和多種疾病中細(xì)胞間生物分子轉(zhuǎn)移的有效載體。外泌體是一類EV，直徑30-150nm，最初根據(jù)其內(nèi)吞起源定義。此外，它們還顯示出多種生物功能，可作為游離細(xì)胞療法。我們之前的研究表明，MSCs-來源的外泌體(MSC-Exo)在抗炎和損傷修復(fù)方面表現(xiàn)出可觀的前景;作為一種納米治療藥物正在被廣泛測試，用于治療糖尿病、中風(fēng)和傷口愈合。然而，就我們所知，MSC-Exo對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的皮膚損傷的治療作用和機(jī)制尚不清楚。
    角質(zhì)形成細(xì)胞占皮膚表皮細(xì)胞的90%，通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、葡萄糖代謝和炎癥介質(zhì)形成屏障，抵御環(huán)境損傷。治療皮膚損傷的一個(gè)重要策略可能涉及調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞的核因子紅樣來源2 (NRF2)信號通路，以應(yīng)對外部氧化刺激。已發(fā)表的研究表明NRF2在皮膚損傷或炎癥后調(diào)節(jié)抗氧化酶的表達(dá)中起著重要作用。NRF2是一種具有帽n領(lǐng)結(jié)構(gòu)的堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子，被Kelch like- ech相關(guān)蛋白1 (Keap1)隔離在細(xì)胞質(zhì)中，并通過泛素化快速降解。以往的研究表明，NRF2通路在皮膚損傷中的內(nèi)部或系統(tǒng)激活會(huì)產(chǎn)生級聯(lián)效應(yīng)，從而產(chǎn)生多種強(qiáng)抗氧化劑，包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和過氧化氫酶(CAT)。此外，在氧化應(yīng)激下，NRF2轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，并與DNA啟動(dòng)子結(jié)合，啟動(dòng)許多抗氧化基因和細(xì)胞保護(hù)蛋白的轉(zhuǎn)錄，如NAD(P)H醌氧化還原酶1 (NQO1)和血紅素加氧酶1 (HO-1)。目前，NRF2已被證明是一種很有前途的分子靶點(diǎn)，用于藥理學(xué)預(yù)防氧化應(yīng)激引起的皮膚損傷。
技術(shù)路線：

結(jié)果：
一、MSC，外泌體和角質(zhì)形成細(xì)胞的鑒定

二、MSC-Exo抑制氧化損傷，促進(jìn)H2O2刺激的角質(zhì)形成細(xì)胞的抗氧化活性和減輕氧化反應(yīng)

    探討MSC-Exo對原代培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞氧化應(yīng)激的治療作用。首先，評估原代培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞的ROS生成(圖2A)和DNA損傷(圖2C)。我們的結(jié)果顯示，MSC-Exo處理顯著降低了H2O2 + Exo組DCF (ROS生成指標(biāo))(圖2B)和8-OHdG (DNA損傷標(biāo)記)(圖2D)的平均熒光強(qiáng)度(MFI)。其次，采用鐵離子還原抗氧化能力(FRAP)、GSH-PX和SOD試劑盒檢測MSC-Exo的抗氧化活性。
    與H2O2 + PBS組相比，MSC-Exo給藥增加了FRAP(圖2E)、GSH-PX(圖2F)和SOD(圖2G)的濃度。此外,貓SOD2的表達(dá),以應(yīng)對氧化挑戰(zhàn)了使用定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)(圖S5)和免疫印跡(圖2 h)和結(jié)果表明,過氧化氫+ PBS組相比,MSC-Exo治療恢復(fù)mRNA和蛋白表達(dá)的貓(圖S5A;圖2I)、SOD2(圖S5B;圖2 k)。
    同時(shí)，用Western blotting檢測各組中GLUT1的表達(dá)情況(圖2H)。我們觀察到，MSC-Exo顯著降低了H2O2 + Exo組中GLUT1的表達(dá)(圖2J)。另外，對照組與對照組+ Exo組在這些試驗(yàn)中均無顯著差異。總之，這些研究結(jié)果表明，MSC-Exo處理可抑制氧化損傷，促進(jìn)H2O2刺激的角質(zhì)形成細(xì)胞的抗氧化活性并減輕氧化反應(yīng)。
    在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞和皮膚損傷中，外泌體療法還通過增加鐵離子降低抗氧化能力和谷胱甘肽過氧化物酶或超氧化物歧化酶活性來提高抗氧化能力。此外，在細(xì)胞或動(dòng)物模型中，它還減輕了細(xì)胞和組織對炎癥和氧化的反應(yīng)。
三、在體外和體內(nèi)，MSC-Exo均下調(diào)氧化應(yīng)激后的NRF2

    為了研究NRF2信號通路是否參與氧化損傷后的sc - exo活性，我們通過免疫染色或Western blotting檢測該通路參與者NRF2、HO-1、NQO1、Keap1的表達(dá)水平。
    當(dāng)NRF2表達(dá)式模式的細(xì)胞(圖7)或動(dòng)物模型(圖S10A)是使用免疫染色檢查,我們發(fā)現(xiàn)MSC-Exo治療抑制NRF2核易位的主要培養(yǎng)角質(zhì)細(xì)胞(圖7)和小鼠皮膚(圖S10A),并且積極的小額信貸機(jī)構(gòu)或利率NRF2相比顯著降低過氧化氫+ PBS組(圖7 b)或紫外線+ PBS組(圖S10B)。與之前的研究結(jié)果一致，
    我們的蛋白分析(圖7C;圖S10C)顯示氧化應(yīng)激誘導(dǎo)NRF2顯著升高(圖7D;圖S10D)、Keap1(圖7E;圖S10E)、HO-1(圖7F;圖S10F)和NQO1(圖S10G, 24h和4d)在角質(zhì)形成細(xì)胞或背側(cè)皮膚中表達(dá)，而在h2o2刺激的角質(zhì)形成細(xì)胞(圖7G)和uv照射小鼠皮膚(圖S10G)第14天(圖S10G)和uv照射小鼠皮膚中NQO1表達(dá)變化未見。
    相反，與UV + PBS組相比，MSC-Exo處理降低了NRF2的相對表達(dá)(圖7D;圖S10D)、Keap1(圖7E;圖S10E, 24h, 4d;)， HO-1(圖7F;圖S10F, 24h, 4d)和NQO1(圖7G;圖:S10G, 24小時(shí)和4天)在h2o2刺激的角質(zhì)形成細(xì)胞和uv照射小鼠皮膚。有趣的是，UV + PBS組和UV + Exo組在UV照射后第14天觀察到HO-1的表達(dá)增加(圖S10F)，而Keap1(圖S10E)和NQO1(圖S10G)的表達(dá)沒有變化。這些結(jié)果表明，在體外和體內(nèi)，MSC-Exo在氧化應(yīng)激后下調(diào)了NRF2。
    總之，NRF2信號通路參與了MSC-Exo的抗氧化活性，而Nrf2基因敲除則減弱了MSC-Exo在體內(nèi)外的抗氧化能力，表明這些作用部分是通過NRF2信號通路介導(dǎo)的。