不同尋常的思路——miR455-3p聯(lián)合m6A修飾發(fā)高分

    已經(jīng)知道熱休克轉錄因子1（HSF1）過表達會促進谷氨酰胺分解并激活結直腸癌（CRC）中的mTOR。然而，HSF1的癌癥特異性過表達的機制仍不清楚。本文在此背景下對該機制進行了解答，發(fā)現(xiàn)了β-catenin抑制miR455-3p表達隨后刺激HSF1 mRNA的m6A修飾并促進其在結直腸癌中的翻譯過程。本文于2020年8月24發(fā)表在《Molecular Cancer》IF：15.302雜志上。

研究結果：
1、β-catenin在CRC中激活HSF1
    為了探究HSF1的潛在調(diào)控，篩選了具有敲除HSF1后類似效果的藥物，如圖1A所示，其中有文獻報道pyrvinium可以抑制HSF表達達到類似敲除的效果。此外，WNT/β-catenin信號通路特征與HSF1正相關（圖1B）。事實證明，pyrvinium減弱了HSF1結合驅動的熒光素酶的活性，并降低了已知由HSF1靶向調(diào)控的基因的表達和結合，如HSP90AA1, HSPA4,HSPB1, and HSPH1 (圖1D和E)。與pyrvinium一致，敲除β-catenin降低了HSF1的活性和其靶向的基因的表達，以及減弱HSF1與靶基因的結合能力（圖1F, G, I）。在結直腸癌細胞系RKO中，β-catenin表達水平較低，且GSK3抑制劑LiCl可以上調(diào)HSF1靶基因表達(圖1h)。
    為了探討HSF1激活與β-catenin信號通路的生物學相關性，分析了LiCl處理前后野生型小鼠胚胎成纖維細胞(WT MEF)和HSF1敲除MEF (HSF1 KO MEF)的基因表達(NCBI GEO: GSE151119)。LiCl處理的HSF1 KO MEF中只有750個基因上調(diào)，而LiCl處理后WT MEF中有1435個基因顯著上調(diào)(圖1j)。其中，有875個基因表現(xiàn)出對HSF1的依賴，一旦HSF1缺失，LiCl處理后其表達水平?jīng)]有上調(diào)(圖1k)。事實上，它們的表達水平與先前報道的HSF1的表達水平有高度相關性(圖1l)。綜上所述，這些結果表明，β-catenin可以正向調(diào)控HSF1。

圖1 WNT/β-catenin信號通路激活HSF1

2、β-catenin促進HSF1蛋白的翻譯
    如圖2a和b所示，pyrvinium and β-catenin敲除均降低了HSF1蛋白水平。相反，外源性的過表達β-catenin增加了HSF1蛋白水平(圖2c)。此外，在RKO和MEF細胞中，LiCl處理激活WNT/ catenin信號后，HSF1蛋白水平均升高(圖2d)。HSF1的表達與原代組織中的β-catenin表達有很好的相關性(圖2e和f)。這些數(shù)據(jù)表明，β-catenin上調(diào)HSF1蛋白表達。嘌呤霉素標記法監(jiān)測新生HSF1蛋白的合成，結果顯示缺失降低了HSF1的嘌呤霉素標記（圖2g），蔗糖梯度離心法的結果顯示β-catenin缺失顯著減少了多聚體部分HSF1 mRNA的存在，但增加了非翻譯核糖體部分(圖2h)。綜上所述，β-catenin是通過刺激HSF1蛋白翻譯上調(diào)HSF1表達。

圖2 β-catenin促進HSF1蛋白的翻譯

3、HSF1蛋白翻譯受miR455-3p調(diào)控
    數(shù)據(jù)庫分析挖掘到兩個潛在的可以與HSF1結合的miRNA，miR455-3p和miR214-5p（圖3A）。此外，它兩都可以降低HSF1的蛋白表達，更重要的是，miR455-3p的抑制劑而不是miR214-5p挽救了由β-catenin敲低引起的HSF1蛋白的下調(diào)（圖3B-C）。一致的，miR455-3p抑制了HSF1驅動的熒光素酶活性，并且HSF1在miR455-3p標記的探針中顯著富集，提示兩者之間的結合關系（圖3D-E）。miR455-3p在腫瘤中下調(diào)表達，其表達與HSF1呈負相關（圖3F-G）。此外，miR455-3p過表達抑制了CRC細胞的增殖，促進其凋亡（圖3H-J）總之，上述結果表明miR455-3p靶向HSF1 mRNA 3 ' -UTR抑制其翻譯。

圖3 HSF1蛋白翻譯受miR455-3p調(diào)控

4、HSF1 mRNA m6A修飾刺激其蛋白翻譯
    除microRNA外，mRNA修飾（例如N6-甲基腺苷（m6A））在HSF1翻譯調(diào)控中也起著重要作用。作者注意到HSF1 mRNA 3'-UTR中miR455-3p種子序列的匹配位點包含m6A修飾的典型基序（圖4a），這得到了生物信息學分析的支持（圖4b）。meRIP后的PCR分析(m6A RNA免疫沉淀)進一步證實了m6A修飾的HSF1 mRNA(圖4c)。更重要的是，在HSF1 mRNA 3 -UTR突變體不能結合miR455-3p，但保留了m6A修飾位點DRACH的載體的熒光素酶活性均高于野生型 (圖3d)，說明METTL3也與HSF1 mRNA結，并且m6A修飾對HSF1表達很重要性。抑制METTL3，HSF1 mRNA的m6A修飾就會減少，HSF1 mRNA m6A修飾的這種減少降低了HSF1蛋白的表達和新生的HSF1蛋白的合成（圖4e-g）。此外，METTL3耗竭顯著減少了多核糖體部分中HSF1 mRNA的存在，但在非翻譯核糖體部分中增加了（圖4h），而HSF1 mRNA或HSF1蛋白的穩(wěn)定性沒有改變。YTHDF1是HSF1 m6A修飾的讀取蛋白，隨著YTHDF1的敲低，HSF1蛋白降低，（圖4i）。綜上所述，HSF1 mRNA的m6A修飾與刺激其翻譯有關。

圖4 HSF1 mRNA m6A修飾刺激其蛋白翻譯

5、β-catenin抑制miR455-3p從而增加HSF1 mRNA的m6A修飾
    隨后，作者探究了miR455-3p與HSF1 mRNA m6A修飾的相互作用，野生型miR455-3p的過表達降低了HSF1 mRNA m6A修飾及其與METTL3的結合，但miR455-3p突變體不能與HSF1 mRNA結合（圖5a）。METTL3缺失不僅降低了m6A對HSF1 mRNA的修飾(圖4e)，而且增強了miR455-3p與HSF1 mRNA的相互作用（圖5b），這些結果表明miR455-3p可能與METTL3競爭HSF1 mRNA的m6A修飾，從而抑制HSF1蛋白的翻譯。
    miR455-3p抑制劑挽救了由β-catenin缺失引起的HSF1 mRNA m6A修飾的減少，同時METTL3與HSF1 mRNA的相互作用也因β-catenin缺失而廢除，伴隨的是miR455-3p與HSF1 mRNA的相互作用增強，以及成熟前體和初級miR455-3p表達上調(diào)（圖5C-F）。相比之下，當過表達或LiCl處理上調(diào)后，成熟miR455-3p和初級miR455-3p均下調(diào)（圖5F-G）。
    初級miR455-3p來源于COL27A1內(nèi)含子10中編碼的一個pre-miRNA發(fā)夾結構，并且COL27A1的表達與miR455-3p的表達顯著正相關（圖5h）。敲除β-catenin后COL27A1的表達顯著上調(diào)，此外β-catenin/TCF7L2復合物可以與COL27A1的啟動子相互作用，同時β-catenin的表達與COL27A1呈負相關（圖I-K）。因此，β-catenin通過抑制miR455-3p的表達，促進HSF1 mRNA由miR455-3p結合向m6A修飾的轉變，最終促進HSF1蛋白的翻譯。

圖5 β-catenin抑制miR455-3p從而增加HSF1 mRNA的m6A修飾

6、HSF1基因和化學抑制均可減輕小鼠的結直腸癌
    根據(jù)體外研究結果，鑒于小鼠中miR455-3p和HSF1 mRNA的相互作用似乎是非常保守的（小鼠miR455-3p種子序列：CAGUCCA；小鼠HSF1 mRNA 3'-UTR中的結合位點：tggactg），進一步探討了HSF1在Apcmin / +和Apcmin / + 和HSF1 +/-小鼠結直腸癌發(fā)生的作用。與正常C57BL / 6相比，Apcmin / +小鼠腸道組織中HSF1及其下游靶標GLS1的表達增加，而miR455-3p的表達減少（圖6a和b）。用高脂飲食喂養(yǎng)3個月后，這些Apcmin / +小鼠的腸內(nèi)出現(xiàn)了多個腫瘤（圖6c）。然而，用HSF1的化學抑制劑KNK437處理的Apcmin / +小鼠中和和Apcmin / + HSF1 +/-的小鼠腫瘤大小和數(shù)量均顯著減少（圖6d），同時伴隨著HSF1靶點的表達下調(diào)（圖6e）。這些結果證實，HSF1是WNT /β-catenin信號傳導的新型下游靶標，對促進CRC的發(fā)展具有重要意義。

圖6 通過激活Wnt信號通路，基因和化學抑制HSF1均可減少結直腸癌的發(fā)生

    總之，本文揭示：當Wnt /β-catenin失活時，miR455-3p（miR455HG）的宿主基因COL27A1的轉錄增加，從而產(chǎn)生更多的miR455-3p來占據(jù)HSF1 mRNA 3'-UTR并阻止其受METTL3介導 m6A修飾，因此抑制了HSF1翻譯。相反，在Wnt /β-catenin激活后，miR455-3p的生成受到抑制，因此HSF1 mRNA可用于METTL3結合和m6A修飾，最終刺激HSF1翻譯以促進結直腸癌發(fā)生（圖6F）。
參考文獻：
Song Ping., Feng Lifeng., Li Jiaqiu., Dai Dongjun., Zhu Liyuan., Wang Chaoqun., Li Jingyi., Li Ling., Zhou Qiyin., Shi Rongkai., Wang Xian., Jin Hongchuan.(2020). β-catenin represses miR455-3p to stimulate m6A modification of HSF1 mRNA and promote its translation in colorectal cancer. Mol. Cancer, 19(1), 129. doi:10.1186/s12943-020-01244-z