circRNA調節(jié)間充質干細胞的成骨分化
脂肪間充質干細胞(Adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)是再生醫(yī)學修復骨缺損不愈合的有前景的候選細胞。但有限的成骨分化潛能極大地阻礙了ADSCs在骨修復中的臨床應用。證據(jù)證明，環(huán)狀RNA(circRNA)參與決定干/祖細胞命運。circRNA如何調節(jié)間充質干細胞的？今日，這篇文章為大家揭曉謎底。
技術路線:
結果:
1. ADSCs中circRNA-vgll3的特征
BMP2誘導的ADSCs進行RNA測序，鑒定出11個高表達、miRNA結合位點的外顯子環(huán)狀RNA。CircRNA-0879（CircRNA-vgll3）來源于vgll3基因的第三個外顯子，該外顯子曾被報道調控MSCs的成骨和成脂分化。引物擴增、Sanger測序及核酸外切酶RNase R處理鑒定circRNA-vgll3具有環(huán)狀結構。在BMP2誘導的ADSC成骨分化過程中，circRNA-vgll3的表達水平逐漸上調，在骨組織的發(fā)育中也明顯上調。FISH實驗證明，CircRNA-vgll3傾向于定位在細胞質。綜上所述，circRNAvgll3是ADSCs中表達的一種穩(wěn)定豐富的circRNA，在ADSC成骨分化過程中內源性表達水平逐漸上調。
2. CircRNA-vgll3正調控ADSC骨生成
利用慢病毒Lenti-CircRNA-vgll3過表達細胞中的CircRNA-vgll3表達，shRNA抑制表達。過表達CircRNA-vgll3顯著增強ADSCs中成骨標志基因的表達，包括Runt相關轉錄因子2(Runx2)、osterix(OSX)、膠原蛋白1 a1(Col1a1)、骨橋蛋白(OPN)、骨鈣素(OCN)和骨唾液蛋白(BSP)，促進ALP活性和鈣沉積。circRNA-vgll3抑制劑則相反。這些表明circRNAvgll3增強了ADSCs的成骨分化。
3. MiR-326-5p通過靶向Itga5調控ADSC骨生成
鑒于circRNA-vgll3在細胞質中大量存在，接下來研究circRNA-vgll3結合miRNA的能力。結合位點預測與qPCR發(fā)現(xiàn)miR-326-5p在BMP2誘導的ADSC成骨分化過程中呈逐漸下調的趨勢。過表達miR-326-5p后，在成骨第7天成骨基因明顯被抑制，提示miR-326-5p負調節(jié)ADSC成骨。靶基因預測與miR-326-5p結合的基因，發(fā)現(xiàn)與ADSC成骨有關的基因Itga5、CRY2和Mapk3，過表達/敲低miR-326-5p后Iga5的表達相反，表明Itga5可能是miR-326-5p的靶基因。成骨第7天Itga5 RNA水平無明顯變化，蛋白水平呈時間依賴性增加。素酶報告實驗證實miR-326-5p可調控Itga5表達。抑制Itga5的表達后，成骨標記被下調，成脂表達和軟骨生成標記無明顯變化，表明Itga5驅動成骨分化。這些數(shù)據(jù)顯示miR-326-5p通過靶向Itga5負調節(jié)ADSC成骨分化。
4. CircRNA-vgll3通過miR-326-5p上調Itga5表達
熒光素酶實驗、RNA下拉實驗、RIP分析、FISH共定位證實在ADSC中circRNA-vgll3可綁定miR-326-5p?；貜蛯嶒烇@示circRNA-vgll3抑制劑明顯抑制成骨基因，與miR-326-5p共轉染時挽救了成骨基因的低表達水平。以上結果表明circRNAvgll3通過miR-326-5p上調Itga5水平在ADSC成骨中發(fā)揮調節(jié)作用。
5. CircRNA-vgll3調節(jié)體內骨形成
探索circRNA-vgll3-的治療作用，建立大鼠骨顱骨臨界大小的缺損模型。將ADSCs接種于Lenti-circRNAvgll3、circRNA-vgll3抑制劑或Lenti-NC轉染的CPC支架上，轉染的ADSCs緊密粘附在CPCs的表面和孔上，有大量ECM纖維網絡。術后8周通過micro-CT重建了新骨，將Lenti-circRNA-vgll3轉染的ADSCs與CPCs組合植入，新骨形成增加。骨密度、骨體積/組織體積和骨小梁數(shù)量增加，表明，circRNA-vgll3在體內正調控ADSCs的骨再生。
過表達組骨面積升高，新骨體積增加，周圍骨組織中的Itga5、Runx2、OSX和OPN升高， 積分光密度升高。這些數(shù)據(jù)揭示了circRNA-vgll3修飾的ADSCs在體內顯著增強新骨形成，提示了它們在治療不愈合骨缺損中的應用潛力。
總結：
1. CircRNA-vgll3直接將miR-326-5p隔離在細胞質中，抑制其活性，進而上調Itga5的蛋白水平，在ADSCs成骨分化中發(fā)揮調節(jié)作用。
2. circRNA-vgll3修飾的ADSCs可以明顯增強體內新骨形成。