m6a+腫瘤生信挖掘, 鑒定了METTL3為肝細(xì)胞癌的不良預(yù)后生物標(biāo)志物

    m6A（N6-methyladenosine，6-甲基腺嘌呤）是真核生物mRNA最常見的一種轉(zhuǎn)錄后修飾，占到RNA甲基化修飾的80%。絕大部分真核生物中， mRNA 5’UTR區(qū)域發(fā)生的甲基化修飾，在mRNA剪接、編輯、穩(wěn)定性、降解、多腺苷酸化等方面發(fā)揮重要功能；而3’UTR區(qū)域發(fā)生的甲基化修飾有助于mRNA的出核轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯起始以及與polyA結(jié)合蛋白一起維持mRNA的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。m6A甲基化酶廣泛參與哺乳動物的發(fā)育，免疫，腫瘤生成和轉(zhuǎn)移，干細(xì)胞更新，脂肪分化等生命過程。

    2020年4月至8月，梅州人民醫(yī)院和廣東省精準(zhǔn)醫(yī)療與客家人群臨床轉(zhuǎn)化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室Gao-Min Liu團(tuán)隊(duì)在Digestive Diseases and Sciences 雜志上發(fā)表了題為“Identifcation of METTL3 as an Adverse Prognostic Biomarker in Hepatocellular Carcinoma”的文章，闡述了m6A相關(guān)基因在肝細(xì)胞癌（HCC）中的作用。作者主要探討了16個m6A相關(guān)基因在HCC中的基因特征，以及這些特征對HCC患者的臨床表現(xiàn)和預(yù)后的預(yù)測價值。
技術(shù)路線:

結(jié)果:
1.m6A相關(guān)的基因表達(dá)和遺傳改變
    在TIMER（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）數(shù)據(jù)庫中，m6A相關(guān)基因在具有特定癌癥模式的癌癥中表達(dá)譜。這里作者分析了16個m6A相關(guān)基因 METTL3，METTL14，RBM15，VIRMA，WTAP，ZC3H13，F(xiàn)TO，ALKBH5，YTHDF1，YTHDF2，YTHDF3，YTHDC1 / 2和IGF2BP1 / 2/3在各種癌癥中的表達(dá)情況（圖1a）。
    其中，除ZC3H13外，在配對的HCC和TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)所有m6A相關(guān)基因在其50個HCC腫瘤樣品中均顯著上調(diào)（圖1b）。
    在cBioportal for Cancer Genomics（http://www.cbioportal.org/）數(shù)據(jù)庫中，有127/366（35％）患者顯示了m6A相關(guān)基因的某些遺傳改變。擴(kuò)增和深度缺失突變是最常見的遺傳變異。 VIRMA是變化最頻繁的與m6A相關(guān)的基因（變化率為16％）（圖1c）。

2.m6A相關(guān)基因的預(yù)后作用
    作者根據(jù)每個基因的最佳切除將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。Kaplan–Meier曲線分析顯示了，晚期TNM分期，較高的METTL3表達(dá)，較高的YTHDF2表達(dá)，較高的YTHDF3表達(dá)，較低的ZC3H13表達(dá)以及無危險因素的患者OS明顯較其同行者差（圖2a– F）。

    晚期TNM分期和METTL3表達(dá)較高的患者RFS明顯較其他患者差（圖2g，h）。

    此外，在TNM I + II和III + IV患者中，較高的METTL3和YTHDF2表達(dá)水平與較差的OS相關(guān)（圖3a，b，e，f）

    在TNM I + II患者中，較低的ZC3H13表達(dá)和較高的METTL3表達(dá)水平與較差的OS和RFS相關(guān)，而在TNM III + IV患者中則不相關(guān)（圖3c，d，i，j）。

    根據(jù)TNM分期對患者進(jìn)行分層時，YTHDF3的表達(dá)與OS無關(guān)（圖3g，h）。

3.METTL3，ZC3H13和YTHDF2在OS預(yù)后中的聯(lián)合效果分析
    METTL3和ZC3H13組合的聯(lián)合效果分析顯示OS在第3組中最差，在第2組中最好。 YTHDF2顯示OS在d組中最差，在a組中最好。 ZC3H13和YTHDF2組合的聯(lián)合效果分析表明，OS在B組中最差，在C組中最佳。METTL3，ZC3H13和YTHDF2組合的聯(lián)合效果分析表明，OS往往是最差的。 IV組和V組中最好。聯(lián)合效果的詳細(xì)分析結(jié)果如表3和圖4所示?？傊琈ETTL3，ZC3H13和YTHDF2的獨(dú)立預(yù)后作用以及聯(lián)合使用的意義這些預(yù)后因素。

4.METTL3的突變，CNV和甲基化分析
    我們進(jìn)一步分析了METTL3失調(diào)的潛在機(jī)制，因?yàn)樗荗S和RFS的獨(dú)立預(yù)后因素。UCSC Xena (https://xenabrowser.net/heatmap/)數(shù)據(jù)庫顯示METTL3 mRNA的表達(dá)與CNV和某些DNA甲基化位點(diǎn)相關(guān)，但與體細(xì)胞突變無關(guān)。來自cBioportal的癌癥基因組學(xué)突變圖進(jìn)一步證實(shí)了366名患者/樣品中METTL3失調(diào)的體細(xì)胞突變的缺乏（圖5b）。

    在cBioportal for Cancer Genomics (http://www.cbioportal.org/)數(shù)據(jù)庫中，366名TCGA-LIHC患者中，以及在CCLE (https://portals.broadinstitute.org/ccle)數(shù)據(jù)庫中的973個癌細(xì)胞系和24個肝癌細(xì)胞系中，METTL3的mRNA表達(dá)與CNV呈正相關(guān)（圖5c– e）。

    METTL3的mRNA表達(dá)在cBioportal for Cancer Genomics (http://www.cbioportal.org/)數(shù)據(jù)庫中的366 TCGA-LIHC患者和21個肝癌細(xì)胞系中與DNA甲基化呈負(fù)相關(guān)，但在CCLE數(shù)據(jù)庫 (https://portals.broadinstitute.org/ccle)中的整個832個癌細(xì)胞系中卻沒有（圖5f–h）。

    DNA基因的身體甲基化，而不是啟動子或CpG島，與MethHC數(shù)據(jù)庫 (http://methhc.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php)中METTL3的mRNA表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（圖5i，j）。此外，在MethSurve (https://biit.cs.ut.ee/methsurv/)數(shù)據(jù)庫中，發(fā)現(xiàn)METTL3的DNA基因體區(qū)域中的cg01993413是HCC中OS的獨(dú)立預(yù)后因素（圖5k）。總之，CNV和DNA基因體甲基化可能是METTL3在肝癌中異常上調(diào)的原因。

5.METTL3的潛在調(diào)控機(jī)制
    總共確定了393個上調(diào)基因和59個下調(diào)基因與METTL3表達(dá)顯著相關(guān)（圖6a）。其中有75個上調(diào)基因和27個下調(diào)基因（22.6％）與肝癌相關(guān)。

    進(jìn)一步的功能富集分析顯示，在胚胎肢體形態(tài)發(fā)生，附件形態(tài)發(fā)生，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)合物和配體門控通道活性（特別是離子通道活性）方面，GO術(shù)語顯著豐富（圖6b）。在高M(jìn)ETTL3組中，沒有KEGG途徑顯著豐富。

    總共鑒定出12個上調(diào)的microRNA和32個下調(diào)的microRNA與METTL3表達(dá)顯著相關(guān)（圖6c）。其中25例（56.8％）與HCC相關(guān)。

    總共鑒定出119個上調(diào)的lncRNA和6個下調(diào)的lncRNA與METTL3表達(dá)顯著相關(guān)（圖6d）。其中，只有四個lncRNA與肝癌相關(guān)

    最后，構(gòu)建了一個包括8個lncRNA，6個microRNA和10個mRNA的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖6e）。

結(jié)論:
    我們的研究鑒定了16個與m6A相關(guān)的基因，尤其是METTL3，這些基因可能是肝癌的潛在預(yù)后生物標(biāo)志物。 此外，鑒定出顯著改變的基因，miRNA，lncRNA，并構(gòu)建了一個ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來解釋肝癌中METTL3的上調(diào)。 但是，還需要進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。