miR-410-非小細(xì)胞肺癌治療靶點

    放射治療是非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的主要治療方法之一，然而固有的或后天的放射抗性限制了其療效。到目前為止，大多數(shù)研究只關(guān)注獲得性耐藥。NSCLC內(nèi)在放射耐受的確切機(jī)制尚不清楚。一些研究表明上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）與NSCLC的放射抗性有關(guān)。然而，對于特異性miRNAs的異常表達(dá)是否同時引起EMT和放射抗性的研究還很少。因此，今天小編為大家?guī)戆l(fā)表于影響因子為13.493的“Signal Transduction and Targeted Therapy”上的文章“miR-410 induces both epithelial–mesenchymal transition and radioresistance through activation of the PI3K/mTOR pathway in non-small cell lung cancer”，給大家詳細(xì)介紹miRNA在肺癌放療中的作用及機(jī)制。

    在本研究中，miR-410是一個重要的調(diào)節(jié)因子，通過靶向PTEN/PI3K/mTOR軸來增強(qiáng)NSCLC的EMT和放射抗性。研究結(jié)果提示miR-410誘導(dǎo)的EMT可能是增強(qiáng)抗輻射能力的重要因素。因此，miR-410可作為NSCLC放療的潛在生物標(biāo)志物或治療靶點。
技術(shù)路線：

結(jié)果：
1.miR-410促進(jìn)NSCLC細(xì)胞系的EMT
    為了了解miR-410在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞EMT和放射反應(yīng)中的作用，我們首先評估了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系（A549、H1299、PC9和SPC-A1）和非癌性支氣管上皮細(xì)胞系（HBE）中miR-410的內(nèi)源性水平。miR-410在NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著高于HBE細(xì)胞，在A549和H1299細(xì)胞中的表達(dá)水平高于PC9和SPC-A1細(xì)胞（圖1a）。因此，建立了穩(wěn)定的miR-410過表達(dá)的PC9和SPC-A1細(xì)胞系（圖1b），并且先前建立的穩(wěn)定的miR-410敲除A549和H1299細(xì)胞系也被用于進(jìn)一步探索miR-410對EMT和體外放射反應(yīng)的影響。有趣的是，miR-410敲除后觀察到A549和H1299細(xì)胞從典型的紡錘狀形態(tài)到鵝卵石狀的形態(tài)變化，而miR-410的異位表達(dá)導(dǎo)致更多的PC9和SPC-A1細(xì)胞呈梭形（圖1c）。此外，A549-Inh和H1299-Inh細(xì)胞上皮標(biāo)志物（E-cadherin）蛋白水平顯著升高，間充質(zhì)標(biāo)志物（N-cadherin、Vimentin和Slug）顯著降低。相反，miR-410過表達(dá)引起了相反的效果（圖1d）。E-鈣粘蛋白和波形蛋白的免疫熒光分析也顯示了類似的結(jié)果（圖1e）。綜上所述，miR-410的過表達(dá)可以促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的EMT過程。

2.miR-410增加NSCLC細(xì)胞的抗輻射性
    為了進(jìn)一步評估m(xù)iR-410對體外放射反應(yīng)的影響，通過克隆存活試驗測定細(xì)胞的放射敏感性。我們的結(jié)果顯示A549-Inh和H1299-Inh細(xì)胞的放射抗性顯著降低，但在PC9miR-410和SPC-A1-miR-410細(xì)胞中卻顯著增加（圖2a）。然后，我們通過檢測DSBs特異性標(biāo)志物γ-H2AX的表達(dá)，進(jìn)一步研究miR-410對輻射誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂（DSBs）的影響。照射后4小時，A549-Inh和H1299-Inh細(xì)胞的γ-H2AX蛋白水平顯著高于PC9-miR-410和SPCA1-miR-410細(xì)胞（圖2b）。此外，免疫熒光檢測到的γ-H2AX病灶在NSCLC細(xì)胞中顯示出類似的結(jié)果（圖2c）。因此，數(shù)據(jù)顯示miR-410增加了NSCLC細(xì)胞的抗輻射性，并可能與增強(qiáng)DSB修復(fù)有關(guān)。

3.miR-410直接靶向PTEN在NSCLC細(xì)胞中的作用
    為了確定miR-410誘導(dǎo)的EMT過程和抗輻射性的機(jī)制，使用TargetScan、DIANA microT-CDS和miRanda來預(yù)測miR-410的靶點（圖3a）。所有三種算法預(yù)測的潛在靶點被提交給DAVID工具進(jìn)行KEGG途徑分析。結(jié)果表明，PTEN是289個潛在靶點之一。此外，先前的研究表明PTEN與EMT和抗輻射性密切相關(guān)。此外，KEGG分析表明，預(yù)測的靶點參與了多種癌癥相關(guān)的途徑（圖3b）。其中，PI3K/Akt和mTOR信號通路已被證實與PTEN密切相關(guān)，這進(jìn)一步表明PTEN可能是miR410的候選靶點。miR-410與PTEN的3’-UTR之間的直接相互作用隨后通過雙熒光素酶報告試驗（圖3c-e）得到證實。此外，在A549-Inh和H1299-Inh細(xì)胞中觀察到PTEN蛋白水平升高，而在PC9-miR-410和SPC-A1-miR-410細(xì)胞中檢測到PTEN的表達(dá)降低（圖3f）。總的來說，這些結(jié)果證實了PTEN是miR-410的直接靶點，并且在NSCLC細(xì)胞中受到miR410的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。

4.miR-410通過激活PI3K/mTOR通路促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的EMT和放射抗性
      研究表明PI3K/mTOR信號通路的激活在調(diào)節(jié)NSCLC的EMT過程或放射敏感性中起著重要作用。因此，基于以上結(jié)果，我們檢測miR-410是否通過激活PI3K/mTOR信號通路發(fā)揮其生物學(xué)功能。值得注意的是，miR-410在PC9和SPC-A1細(xì)胞中的過表達(dá)顯著增加了磷酸化Akt和mTOR的水平，導(dǎo)致P70S6K和4E-BP1的磷酸化增強(qiáng)。相反，A549和H1299細(xì)胞中miR-410的敲除顯著降低磷酸化Akt、mTOR、P70S6K和4E-BP1的水平（圖4a）。這些結(jié)果表明miR-410確實激活了NSCLC細(xì)胞的PI3K/mTOR通路?；谏鲜鼋Y(jié)果，miR-410過表達(dá)可促進(jìn)EMT和體外抗輻射性，我們接下來研究了PI3K、Akt或mTOR通路的特異性阻斷對miR-410過表達(dá)PC9和SPCA1細(xì)胞的EMT和放射抗性的影響。首先確認(rèn)不同劑量的PI3K抑制劑（LY294002）、Akt抑制劑（MK-2206）和mTOR抑制劑（雷帕霉素）的有效性（圖4b）。進(jìn)一步結(jié)果顯示，特異性PI3K、Akt或mTOR抑制劑顯著降低了PC9-miR-410和SPC-A1-miR-410細(xì)胞中N-cadherin、Vimentin和Slug的表達(dá)，而提高了E-cadherin的表達(dá)（圖4c）。此外，在PI3K、Akt或mTOR途徑的抑制下，PC9-miR-410和SPC-A1-miR-410細(xì)胞中γ-H2AX的蛋白質(zhì)水平和核病灶顯著增加（圖4d，e）。類似地，用PI3K、Akt或mTOR抑制劑處理后，PC9-miR-410和SPC-A1-miR-410細(xì)胞的抗輻射性顯著降低（圖4f）。因此，這些數(shù)據(jù)表明miR-410通過激活PI3K/mTOR信號傳導(dǎo)促進(jìn)了NSCLC細(xì)胞的EMT過程和抗輻射能力。

5.PTEN逆轉(zhuǎn)miR-410誘導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞EMT和放射抗性的恢復(fù)
    我們進(jìn)一步研究了PTEN是否是PI3K/mTOR激活的關(guān)鍵，從而導(dǎo)致miR-410在NSCLC細(xì)胞中的生物學(xué)功能。將PTEN表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，PTEN蛋白水平顯著增加（圖5a）。此外，#1sipten在293T細(xì)胞中表現(xiàn)出最顯著的PTEN mRNA降低（圖5b）。此外，進(jìn)一步證實了pVax-PTEN和siPTEN分別在miR-410過表達(dá)或敲除的NSCLC細(xì)胞中的有效性（圖5c）。事實上，PC9-miR-410和SPC-A1-miR-410細(xì)胞中PTEN表達(dá)的恢復(fù)顯著抑制了N-鈣粘蛋白、波形蛋白和Slug的表達(dá)，并增加了Ecadherin的表達(dá)（圖5d）。此外，PTEN表達(dá)的恢復(fù)顯著降低了PC9-miR-410和SPC-A1-miR-410細(xì)胞中磷酸化的Akt、mTOR、P70S6K和4E-BP1的水平（圖5e）。經(jīng)PTEN修復(fù)后，PC9-miR-410和SPC-A1-miR-410細(xì)胞的γ-H2AX表達(dá)水平和放射敏感性顯著提高（圖5f-h）。相反，在A549-Inh和H1299-Inh細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siPTEN會產(chǎn)生相反的效果（圖5d–g）?？傊@些數(shù)據(jù)表明PTEN在miR-410誘導(dǎo)的PI3K/mTOR通路的激活中起重要作用，從而增強(qiáng)了NSCLC細(xì)胞的EMT和放射抗性。

6.miR-410過表達(dá)可促進(jìn)EMT和體內(nèi)抗輻射性，并與PTEN/PI3K/mTOR軸有關(guān)
    為了確定miR-410過表達(dá)是否能促進(jìn)EMT，將SPC-A1-miR-410細(xì)胞注入小鼠側(cè)腹，并使用先前建立的A549-Inh皮下腫瘤模型。與體外結(jié)果一致，在SPC-A1-miR-410腫瘤中，波形蛋白和Slug的染色顯著增加，而E-鈣粘蛋白顯著降低（圖6a）。E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白、波形蛋白和Slug的蛋白質(zhì)水平也顯示出相似的結(jié)果。在SPC-A1-miR410腫瘤組織中也觀察到磷酸化Akt、mTOR、P70S6K和4E-BP1的表達(dá)水平升高（圖6b）。值得注意的是，SPC-A1-miR-410組PTEN的蛋白水平和免疫組化染色均顯示出顯著的下調(diào)（圖6b，c）。相反，對A549-Inh腫瘤的研究顯示了相反的結(jié)果（圖6a-c）。因此，這些數(shù)據(jù)表明miR-410過表達(dá)可增強(qiáng)體內(nèi)EMT過程，并與靶向PTEN同時激活PI3K/mTOR通路有關(guān)。
    此外，為了探討miR-410過表達(dá)對體內(nèi)放射反應(yīng)的影響，隨機(jī)給皮下腫瘤小鼠注射RT 或 mock RT。與SPC-A1-miR-NC腫瘤相比，SPC-A1-miR-410腫瘤具有更強(qiáng)的抗輻射能力，其生長延遲更短（圖6d）。此外，與放射治療的SPC-A1miR-NC腫瘤相比，放射治療的SPC-A1miR-410腫瘤的γ-H2AX蛋白水平顯著降低（圖6e）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明miR-410的過表達(dá)促進(jìn)了體內(nèi)DSB修復(fù)的增強(qiáng)，并且體內(nèi)增強(qiáng)的抗輻射能力也與PTEN/PI3K/mTOR軸的激活有關(guān)。

7.miR-410高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌組織中EMT和PTEN低表達(dá)相關(guān)
    為了探討miR-410與EMT過程的臨床相關(guān)性，我們收集了62例NSCLC標(biāo)本。然后，檢測miR-410和EMT標(biāo)記的表達(dá)水平，并根據(jù)我們定義的標(biāo)準(zhǔn)對EMT表型進(jìn)行分類（圖7a）。miR-410高和低表達(dá)組被鑒定。間質(zhì)和EMT表型更可能在高miR-410表達(dá)的患者中發(fā)現(xiàn)（圖7b）。此外，80.65%的miR-410高表達(dá)標(biāo)本顯示PTEN的低表達(dá)，58.06%的miR-410低表達(dá)標(biāo)本顯示PTEN的高表達(dá)（圖7c，d）。最后，我們探討了PTEN的表達(dá)與EMT標(biāo)記的相關(guān)性。值得注意的是，在360例肺腺癌（TCGA）和325例肺鱗癌（TCGA）中，PTEN蛋白水平與E-cadherin水平呈正相關(guān)（圖7e）。因此，這些數(shù)據(jù)初步表明miR-410與TCGA-NSCLC標(biāo)本EMT過程呈正相關(guān)。

結(jié)論：
    我們發(fā)現(xiàn)miR-410通過靶向PTEN/PI3K/mTOR軸，在體外和體內(nèi)均可誘導(dǎo)NSCLC-EMT和放射抗性，其增強(qiáng)與DNA損傷修復(fù)有關(guān)。此外，miR-410誘導(dǎo)的EMT可顯著增強(qiáng)NSCLC的抗輻射能力。對NSCLC標(biāo)本的進(jìn)一步研究也表明miR-410與EMT呈正相關(guān)。因此，miR-410可能作為NSCLC RT的潛在生物標(biāo)志物或治療靶點，在抑制EMT相關(guān)惡性腫瘤的同時，可以提高治療效率。