缺氧對(duì)細(xì)胞內(nèi)鐵的影響（鐵自噬，鐵死亡，線粒體鐵蛋白）
在生理水平上，鐵是維持幾個(gè)代謝途徑所必需的，而在缺血/再灌注、腎損傷或癌癥等各種病理?xiàng)l件下，過(guò)量的游離鐵可能導(dǎo)致氧化損傷或引起細(xì)胞死亡。但是人類巨噬細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。德國(guó)法蘭克福歌德大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)研究所的Dominik C. Fuhrmann等人在Redox Biology（IF=9.986）上發(fā)表文章探究人類巨噬細(xì)胞中，缺氧與鐵自噬，線粒體鐵蛋白，鐵死亡的關(guān)系。
技術(shù)路線圖：
研究結(jié)果：
1.缺氧狀態(tài)下巨噬細(xì)胞的鐵狀態(tài)
測(cè)定人巨噬細(xì)胞和細(xì)胞上清液中的鐵含量(圖1A和B)。在缺氧16h后，細(xì)胞內(nèi)鐵下降，而上清液中的鐵略有上升。結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞在缺氧條件下獲得鐵輸出表型。這與膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(FPN)是HIF-2的靶基因的研究一致。二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體1 (DMT1)和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)參與鐵的輸入。雖然DMT1 mRNA表達(dá)保持不變, TfR mRNA從缺氧4 h時(shí)開(kāi)始減少 (圖1 C和D)。基因結(jié)果顯示鐵轉(zhuǎn)出，從低氧處理8 h開(kāi)始，血漿銅藍(lán)蛋白(CP)和FPN顯著增加(圖1 E和F)。研究顯示低氧條件下細(xì)胞內(nèi)的鐵減少。檢測(cè)與鐵儲(chǔ)存相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)從低氧8 h開(kāi)始，鐵蛋白重鏈(FTH)和輕鏈(FTL) mRNA的表達(dá)增加(圖1G和H)。線粒體鐵蛋白(FTMT)的mRNA并不受缺氧影響，說(shuō)明HIF不可能直接調(diào)控人巨噬細(xì)胞中的FTMT (圖1I)。NCOA4和PCBP1對(duì)于從儲(chǔ)存蛋白中釋放鐵是至關(guān)重要的。PCBP1，HERC2的mRNA 的表達(dá)量在缺氧下沒(méi)有改變。NCOA4的mRNA表達(dá)在缺氧4小時(shí)后達(dá)到顯著水平(圖1L)。NCOA4可引導(dǎo)鐵蛋白進(jìn)入自噬溶酶體。NCOA4 mRNA的減少可能提示了鐵自噬與缺氧之間的聯(lián)系。
2.缺氧條件下，鐵自噬減少
Western分析NCOA4的表達(dá)，探究缺氧狀態(tài)下鐵自噬是否受限(圖2A)。與mRNA結(jié)果一致，NCOA4蛋白在缺氧4小時(shí)時(shí)顯著下降。以往研究表明NCOA4被自噬相關(guān)蛋白(ATG)激活，引導(dǎo)FTH和FTL到自噬小體。低表達(dá)NCOA4應(yīng)能增強(qiáng)低氧下的鐵蛋白豐度。因此,我們分析了FTH、FTL和FTMT在蛋白質(zhì)水平(圖2B-D)。缺氧4 h后, 所有鐵蛋白亞型顯著增加, 16-24 h后，增加更明顯。抑制NCOA4可以顯著提高FTH和FTMT蛋白的表達(dá)(圖2E)，而FTL并不顯著。鐵輸出增加與鐵蛋白穩(wěn)定輸入減少可能表明在低氧條件下，巨噬細(xì)胞利用這一機(jī)制減少細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定的鐵儲(chǔ)存，以減少氧化還原應(yīng)激。
3. NCOA4的調(diào)節(jié)依賴JNK
SP600125抑制JNK，LY294002抑制PI3K，SB203580抑制p38MAPK， AKT VIII抑制AKT，使用雷帕霉素抑制mTOR，并在常氧和缺氧條件下測(cè)定NCOA4 mRNA的表達(dá)(圖3A)。NCOA4 mRNA在缺氧狀態(tài)下降低，只有SP600125和LY294002挽救了這種降低。常氧條件下，SP600125對(duì)JNK的抑制也增加了NCOA4 mRNA，說(shuō)明JNK對(duì)NCOA4的負(fù)調(diào)控作用。然后在蛋白水平上驗(yàn)證了這些發(fā)現(xiàn)(圖3B)。
4. NCOA4 mRNA是miR-6862-5p的一個(gè)靶點(diǎn)
JNK已知可以增加靶基因的轉(zhuǎn)錄，JNK也可能增強(qiáng)了miR的表達(dá)。NCOA4是miR-6862-5p的候選靶標(biāo)。阻斷JNK顯著減少了miR-682-5p的數(shù)量(圖3D)。在常氧和缺氧條件下，拮抗miR-6862-5p可顯著增加NCOA4 mRNA的表達(dá)(圖3E)。為了評(píng)估m(xù)iRNA拮抗劑的有效性，我們測(cè)量了miR-6862-5p及其預(yù)測(cè)靶點(diǎn)THBD的表達(dá)。在常氧狀態(tài)下，miRNA拮抗劑顯著降低miR-6862-5p的表達(dá)，同時(shí)THBD mRNA的含量增加。由于THBD對(duì)缺氧有反應(yīng)，miRNA拮抗劑在低氧條件下是無(wú)效的。研究證實(shí)JNK是miR-6862-5p的調(diào)控因子，并驗(yàn)證了NCOA4和THBD是miR-6862-5p在人巨噬細(xì)胞中的新靶點(diǎn)。
5. 低氧狀態(tài)下，NCOA4的穩(wěn)定降低了FTMT的表達(dá)，而不降低FTH的表達(dá)
文章分析低氧條件下SP600125處理巨噬細(xì)胞FTMT和FTH的表達(dá)(圖3F和G)。這些抑制劑對(duì)常氧條件下FTMT和FTH的表達(dá)沒(méi)有影響。阻斷JNK后，低氧下FTMT的增加被逆轉(zhuǎn)。缺氧時(shí)FTH也增加，但SP600125無(wú)法干預(yù)。即在缺氧條件下，只有FTMT受NCOA4的調(diào)控。
siRNA在抑制JNK活性的同時(shí)抑制NCOA4。然而，在常氧條件下，SP600125對(duì)FTMT的表達(dá)沒(méi)有影響，而NCOA4的敲低則使FTMT蛋白表達(dá)增加到缺氧條件下的水平(圖3H)。
NCOA4 mRNA在缺氧狀態(tài)下的快速下降表現(xiàn)為miR-6862-5p對(duì)mRNA的持續(xù)降解和低氧轉(zhuǎn)錄減弱的共同作用。由于低氧條件下NCOA4的減少，鐵自噬減少，F(xiàn)TMT隨之增加(圖3I)。
6. RSL-3增加FTMT和FTH
文章中用GPX4抑制劑和鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL-3處理巨噬細(xì)胞后，測(cè)定FTMT和FTH的表達(dá)(圖4A和B)。RSL-3結(jié)合Lip，以防止脂質(zhì)過(guò)氧化,從而抑制鐵死亡。在沒(méi)有或存在Lip的情況下，用RSL-3處理細(xì)胞(圖4C)。在常氧和缺氧條件下，存活率均無(wú)明顯變化。丙二醛(MDA)沒(méi)有改變(圖4D)。RSL-3在常氧條件下誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的FTH和FTMT，在缺氧條件下甚至更強(qiáng)，但在這些細(xì)胞中沒(méi)有啟動(dòng)鐵死亡。這說(shuō)明了FTMT和FTH可能保護(hù)巨噬細(xì)胞免受鐵死亡。
7. FTMT和FTH對(duì)缺氧狀態(tài)下的鐵死亡有干擾作用
RSL-3只有在siFTMT或siFTMT/FTH時(shí)降低常氧狀態(tài)下的細(xì)胞存活率 (圖4E)。在缺氧條件下，抑制FTMT使RSL-3不能降低細(xì)胞存活率。為了研究siFTH/FTMT細(xì)胞的存活率是通過(guò)鐵死亡發(fā)生的，Lip用于挽救巨噬細(xì)胞的死亡(圖4F)。在低氧條件下，RSL-3處理的siFTMT/FTH細(xì)胞存活率的降低可被Lip逆轉(zhuǎn)。數(shù)據(jù)表明，在缺氧條件下，兩種鐵蛋白都具有保護(hù)作用，這與RSL-3處理后FTMT和FTH的顯著誘導(dǎo)一致(圖4A和B)。在巨噬細(xì)胞中，JNK作用于miR-6862-5p來(lái)降解NCOA4 mRNA。同時(shí)考慮到缺氧會(huì)降低NCOA4 mRNA的轉(zhuǎn)錄，這些聯(lián)合作用會(huì)降低NCOA4的蛋白量(圖5)。
8. 腫瘤細(xì)胞NCOA4高表達(dá)而FTMT低表達(dá)
如圖6A，HT1080細(xì)胞缺氧可誘導(dǎo)FTMT。HT1080細(xì)胞中FTH的基礎(chǔ)表達(dá)高于巨噬細(xì)胞，但對(duì)缺氧的反應(yīng)較弱。HT1080細(xì)胞常氧狀態(tài)下NCOA4水平較高，但在缺氧狀態(tài)下NCOA4沒(méi)有下調(diào)。在HT1080細(xì)胞中siRNA NCOA4，使FTMT和FTH增加，表明這兩種蛋白受到NCOA4的調(diào)控(圖6B和C)。
9. 缺氧保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受RSL-3誘導(dǎo)鐵死亡
在形態(tài)上，RSL-3處理的細(xì)胞從成纖維變成圓形，Lip抑制這種作用。在低氧HT1080細(xì)胞中，F(xiàn)TH的表達(dá)顯著增加，而FTMT的表達(dá)不受RSL-3或Liproxstatin-1的影響(圖6D和E)。常氧和低氧HT1080細(xì)胞存活率沒(méi)有顯著差異(圖6F)。RSL-3降低了HT1080大約50%的生存能力，這可以由Lip完全補(bǔ)償。在缺氧條件下，RSL-3效率較低，僅降低了約25%的細(xì)胞存活率，這是由于鐵死亡。siRNA FTH并在缺氧條件下孵育24小時(shí)(圖6G)。FTH對(duì)HT1080細(xì)胞存活至關(guān)重要。暗示FTH的降低可能會(huì)增加游離鐵，引發(fā)鐵化學(xué)相關(guān)的脂質(zhì)死亡 (圖6H)。
在巨噬細(xì)胞中，缺氧降低了NCOA4，從而增加了FTMT和FTH的水平(圖6I)。
總結(jié)：
缺氧條件下鐵自噬減少;JNK對(duì)NCOA4負(fù)調(diào)控，且NCOA4是miR-6862-5p的其中一個(gè)靶點(diǎn);缺氧保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受鐵死亡誘導(dǎo)劑的影響;研究為闡明缺氧和鐵死亡的關(guān)系提供借鑒意義。