EIF3H，食管鱗癌的潛在新靶標

    食管癌是全球第七大常見癌癥和第六大常見癌癥死亡原因。食管鱗狀細胞癌（ESCC）約占全球食管癌病例的90%，其中50%以上的ESCC發(fā)生于中國。食管癌五年生存率在30%以下，主要是因為早期診斷的臨床方法有限以及診斷前腫瘤轉移和腫瘤復發(fā)。目前，這些過程的分子機制仍不明確。近期，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院的劉志華教授課題組通過TCGA數(shù)據(jù)庫選定了在食管癌組織中表達水平高的EIF3H分子，發(fā)現(xiàn)EIF3H能夠促進ESCC的發(fā)生、生長和轉移，且EIF3H可能是一種去泛素化酶，能穩(wěn)定Snail蛋白水平，且揭示了EIF3H-Snail信號軸在ESCC侵襲過程中的重要作用，并提供了EIF3H作為ESCC治療生物標志物的證據(jù)。相關研究以“EIF3H promotes aggressiveness of esophageal squamous cell carcinoma by modulating Snail stability”為題發(fā)表在Journal of Experimental & Clinical Cancer Research雜志上，雜志影響因子7.068。
研究思路：

1. TCGA數(shù)據(jù)庫挖掘在食管癌中高表達的基因，并在體內(nèi)外驗證EIF3H在ESCC中高表達。

2. 探究EIF3H對ESCC發(fā)生、生長、遷移和侵襲的影響。

3. 確定EIF3H的下游靶標（Snail）。

4. 探究EIF3H與Snail相互作用以及對ESCC的影響。

結果：
1.EIF3H在食管癌中的表達情況
    作者根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫分析了EIF3H在食管癌中的表達情況，發(fā)現(xiàn)EIF3H在食管癌組織中表達顯著上調（A），隨后對人食管上皮細胞和食管鱗狀細胞癌（ESCC）細胞系進行免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)EIF3H在腫瘤細胞系中高表達（B），且免疫組化分析顯示ESCC組織中EIF3H的表達明顯高于鄰近的正常食管上皮組織（C，D）。綜上所述，這些結果表明EIF3H在ESCC中高表達。

2.EIF3H在體內(nèi)外對ESCC發(fā)生和生長的作用
    為了研究EIF3H在腫瘤進展中的功能，作者使用EIF3H過表達或沉默的KYSE150和KYSE510細胞來探究EIF3H對細胞生長的影響，通過免疫印跡和RT-PCR檢測EIF3H在這些細胞中過表達或敲除的效果（A-D），發(fā)現(xiàn)EIF3H過表達引起KYSE150和KYSE510細胞的增殖增加（E，F(xiàn)），而EIF3H沉默顯著降低了細胞增殖（G，H）。此外，在體內(nèi)異種移植模型中注射EIF3H沉默的KYSE150細胞的小鼠腫瘤生長和Ki67陽性百分率顯著降低（I-J）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明EIF3H在ESCC腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中對細胞增殖有重要作用。

3.EIF3H對ESCC細胞轉移表型影響
    作者進一步研究EIF3H對ESCC細胞遷移和侵襲的作用，通過transwell實驗發(fā)現(xiàn)EIF3H過表達能顯著增加KYSE150和KYSE510細胞遷移和侵襲能力（A，B），而EIF3H沉默削弱了這些能力（C，D）。肺轉移模型試驗發(fā)現(xiàn)注射EIF3H沉默細胞的小鼠肺組織中缺乏轉移性結節(jié)，肺重量明顯輕于對照組（E）。綜上所述，這些結果表明EIF3H沉默抑制了ESCC細胞遷移和腫瘤轉移。

4.EIF3H與Snail相互作用
    通過co-IP和LCMS/MS檢測了與EIF3H相互作用的蛋白（A），由于Snail是EMT相關的轉錄因子，排名靠前，引起了作者的注意。為了證實EIF3H和Snai之間的相互作用，將EIF3H-flag和Snai共同表達在HEK293T細胞中進行co-IP實驗，免疫沉淀EIF3H后檢測到了Snail（B）且EIF3H和Sna-flag共同表達分析觀察到類似的結果（C）。KYSE510細胞的內(nèi)源性Snail免疫沉淀也證實了內(nèi)源性Snail與EIF3H之間的相互作用（D）。通過免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性EIF3H和Snail在 KYSE510細胞的細胞質共定位（E），且在HEK293T細胞中Snail的6個截斷的突變體或Snail全長與EIF3H共表達時發(fā)現(xiàn)缺失S-P結構域的Snail突變體失去了與EIF3H相互作用的能力（F）。這些結果揭示了EIF3H與Snail之間的相互作用是通過Snail 的S-P結構域介導的。

5.EIF3H通過去泛素化穩(wěn)定Snail
    作者在HEK293T細胞中共同表達了Snail與EIF3H，發(fā)現(xiàn)EIF3H明顯上調了Snail蛋白，但對Snail mRNA水平?jīng)]有影響（A），采用CHX脈沖追蹤法檢測EIF3H通過阻斷蛋白合成對Snail穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)過表達EIF3H可以顯著穩(wěn)定Snail蛋白水平，而轉染載體的細胞中Snail蛋白明顯降解（B）。HEK293T細胞中EIF3H與Snail共同表達時發(fā)現(xiàn)過表達EIF3H可以消除Snail的泛素化（C），并延長了Snail的半衰期（D，E），而內(nèi)源性的Snail在 EIF3H沉默后變得不穩(wěn)定并加速降解（F，G），且內(nèi)源泛素化實驗發(fā)現(xiàn)過表達EIF3H去泛素化內(nèi)源性Snail（H），而EIF3H的沉默促進了內(nèi)源性Snail的泛素化（I）。這些結果表明EIF3H可能是一種新型的維持Snail蛋白穩(wěn)定性的去泛素化酶。

6.EIF3H在ESCC細胞中促進Snail介導的EMT
    作者研究了過表達EIF3H細胞中Snail和EMT相關標記的表達情況，發(fā)現(xiàn)EIF3H表達增加了Snail蛋白水平，同時使上皮標志物(E-cadherin)蛋白水平降低，間充質標志物(N-cadherin和Vimentin)蛋白水平升高（A），而EIF3H沉默細胞中抑制了Snail蛋白水平，上調了E-cadherin蛋白以及下調了N-Cadherin和Vimentin蛋白的表達（B）。在KYSE150-EIF3H過表達或對照細胞中同時沉默Snail，發(fā)現(xiàn)能夠逆轉EIF3H對KYSE150細胞遷移和侵襲能力的促進作用（C），而Snail在缺失EIF3H的KYSE150細胞中異位表達極大地增加了遷移和侵襲的細胞數(shù)量，幾乎抵消了EIF3H沉默的影響（D）?？偟膩碚f，這些結果表明EIF3H可以促進ESCC細胞中Snail介導的EMT。

7.ESCC中EIF3H與Snail水平呈正相關
    作者通過尾靜脈注射模型研究了EIF3H沉默的KYSE150細胞在肺組織的作用，發(fā)現(xiàn)EIF3H的下調抑制了體內(nèi)Snail和Snail介導的EMT開關的表達，且對照組肺組織中Ki67陽性腫瘤細胞百分比也略高于EIF3H沉默組（A），隨后通過包含73對ESCC組織的組織芯片檢測了EIF3H和Snail的臨床相關性，發(fā)現(xiàn)EIF3H的表達水平與ESCC組織樣本中Snail的表達水平呈正相關（B，C）。以上數(shù)據(jù)表明EIF3H是穩(wěn)定Snail和ESCC侵襲性必需的因子。

結論：
    本研究發(fā)現(xiàn)過表達EIF3H可促進ESCC發(fā)生、生長和轉移。EIF3H可能是一種穩(wěn)定Snail蛋白水平的去泛素化酶，且與Snail表達水平呈正相關，表明了 EIF3H-Snail信號軸在ESCC腫瘤侵襲性中的重要作用，為ESCC治療提供了一個很有前途的生物標志物。
參考文獻：
Xiaobin Guo, Rui Zhu, Aiping Luo, et al. EIF3H promotes aggressiveness of esophageal squamous cell carcinoma by modulating Snail stability. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 2020, 39(1): 175.