非編碼RNA編碼蛋白在腫瘤中的作用

    lncRNA一般被認(rèn)為是沒(méi)有編碼蛋白能力的RNA，但是近期研究證明非編碼RNA具有編碼蛋白的能力，并在腫瘤中發(fā)揮重要作用。今天來(lái)講一篇關(guān)于lncRNA通過(guò)編碼蛋白質(zhì)促進(jìn)結(jié)腸癌（CRC）進(jìn)展的文章，題名為：Small Protein Hidden in lncRNA LOC90024 Promotes "Cancerous" RNA Splicing and Tumorigenesis，發(fā)表在Advanced Science期刊上，IF=15.84。

技術(shù)路線：

    作者首先使用了核糖體RIP對(duì)結(jié)合核糖體的RNA進(jìn)行純化，并通過(guò)RNA測(cè)序技術(shù)分析顯示lncRNA LOC90024可以與核糖體結(jié)合，這表明LOC90024可能以lncRNA分子的形式翻譯為蛋白質(zhì)/肽或參與翻譯調(diào)控。生物信息學(xué)分析表明，LOC90024中存在一個(gè)393個(gè)核苷酸的ORF，可能編碼130個(gè)氨基酸的小蛋白。將這種小蛋白命名為SRSP。同源性分析表明，SRSP在靈長(zhǎng)類動(dòng)物（中高度保守，但在SRSP中沒(méi)有經(jīng)典的結(jié)構(gòu)域，這表明SRSP是一種功能未知的新型蛋白質(zhì)。為了確認(rèn)lncRNA LOC90024中的預(yù)測(cè)ORF可以翻譯，將預(yù)測(cè)ORF中的起始密碼子ATG突變?yōu)锳TT。突變后消除了SRSP-GFP或SRSP-Flag融合蛋白的表達(dá)。通過(guò)質(zhì)譜進(jìn)一步鑒定了SRSP-GFP蛋白?？偟膩?lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)表明lncRNA LOC90024實(shí)際上編碼一種小蛋白SRSP。

    天然的內(nèi)源性SRSP存在于結(jié)直腸癌，乳腺癌，卵巢癌和鼻咽癌癌細(xì)胞中，結(jié)腸癌和癌旁組織存在天然的內(nèi)源性SRSP。質(zhì)譜鑒定并驗(yàn)證了癌組織中天然內(nèi)源產(chǎn)生的SRSP。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，SRSP是人類細(xì)胞和組織內(nèi)源性自然產(chǎn)生的。IHC）分析了101個(gè)CRC組織樣本和79個(gè)正常樣本（包括79對(duì)CRC組織及其匹配組織）中的SRSP表達(dá)水平。CRC組織中SRSP表達(dá)水平顯著高于相鄰的癌旁組織。高SRSP水平的CRC患者比低SRSP水平的CRC癌癥死亡風(fēng)險(xiǎn)更高。

    進(jìn)一步研究LOC90024和SRSP在CRC腫瘤發(fā)生中的功能，使用CRISPR‐Cas9技術(shù)構(gòu)建了LOC90024基因敲除（KO）細(xì)胞。LOC90024的 KO 可顯著抑制癌細(xì)胞的增殖，集落形成，遷移和侵襲。在LOC90024 KO細(xì)胞恢復(fù)了lncRNA表達(dá)，LOC90024 ORF和5'UTR-ORF構(gòu)建體可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，集落形成，遷移和侵襲，而LOC90024 5'UTR-ORFmut構(gòu)建體不會(huì)改變CRC細(xì)胞的增殖，集落形成，遷移和侵襲。ORFmut標(biāo)志 5'UTR-ORFmut-Flag表達(dá)的體內(nèi)異種移植腫瘤生長(zhǎng)與空白載體表達(dá)相似。這些數(shù)據(jù)表明，SRSP而非LOC90024 lncRNA本身可促進(jìn)腫瘤發(fā)生。

    為了揭示SRSP促進(jìn)腫瘤發(fā)生和癌癥進(jìn)展的機(jī)制，通過(guò)蛋白組學(xué)分析尋找了SRSP的相互作用蛋白。質(zhì)譜鑒定出總共574種SRSP相互作用蛋白。GO分析顯示，這些與SRSP相互作用的蛋白主要被歸類為RNA結(jié)合蛋白，這表明SRSP可能主要通過(guò)與剪接調(diào)節(jié)劑相互作用來(lái)調(diào)節(jié)RNA剪接。SRSF3是一種RNA剪接因子和RNA結(jié)合蛋白。實(shí)驗(yàn)證實(shí)SRSP可以與SRSF3相互作用。進(jìn)一步研究了SRSP是否通過(guò)RNA與SRSF3相互作用。在存在RNase處理的情況下，SRSP仍與SRSF3相互作用，表明SRSP與SRSF3的相互作用不依賴于RNA。
    SRSF家族蛋白在N端包含一個(gè)RRM以與RNA結(jié)合，在C端包含一個(gè)RS結(jié)構(gòu)域以與其他伴侶蛋白結(jié)合。將C端和N端突變?cè)贖EK293T細(xì)胞中共表達(dá)。只有包含N末端的SRSF3才能與SRSP相互作用。為了確定SRSP的哪些區(qū)域或殘基與SRSF3相互作用，構(gòu)建了一系列SRSP-Flag突變體，我們證明了SRSP（1–60 aa）的N末端與SRSF3相互作用。只有包含16-30個(gè)aa區(qū)域的SRSP才能與SRSF3相互作用，而該區(qū)域的脯氨酸-精氨酸-精氨酸（PRR）基序?qū)τ谙嗷プ饔貌皇潜匦璧?，確認(rèn)SRSP的16-22aa區(qū)域與SRSF3相互作用。4J）。因此，SRSP中的GQPCGSP氨基酸（16-22氨基酸區(qū)域）是其與SRSF3 N末端相互作用的原因。

    發(fā)現(xiàn)SRSP促進(jìn)了TF Sp4外顯子3的摻入，從而促進(jìn)了長(zhǎng)Sp4剪接變體形成（L-Sp4），并抑制了沒(méi)有外顯子3的短Sp4剪接變體形成（-S-Sp4）-。 當(dāng)敲除SRSP表達(dá)時(shí)，有靶向RNA測(cè)序證實(shí)了Sp4外顯子3的敲除。SRSF3結(jié)合位點(diǎn)的突變完全廢除了SRSF3與Sp4 E3（848–866）RNA探針的結(jié)合。 但是，SRSP本身并未直接結(jié)合這些Sp4外顯子3 RNA探針，這表明SRSP無(wú)法直接識(shí)別并結(jié)合Sp4外顯子3。進(jìn)一步研究了SRSP對(duì)SRSF3與Sp4外顯子3結(jié)合的影響。 我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)SRSF3結(jié)合位點(diǎn)在Sp4的外顯子3中發(fā)生突變時(shí)，SRSP的過(guò)表達(dá)顯著增強(qiáng)了SRSF3與Sp4的E3（848-866）的結(jié)合，但并未誘導(dǎo)SRSF3與Sp4的第4外顯子結(jié)合。此外，SRSF3與Sp4外顯子3的結(jié)合以SRSP劑量依賴性方式增加。

    鑒于SRSP增強(qiáng)了SRSF3對(duì)Sp4外顯子3的結(jié)合和識(shí)別，進(jìn)一步研究了SRSP對(duì)Sp4 premRNA剪接的影響。 LOC90024的KO損害了Sp4外顯子3的包含，從而減少了L‐Sp4的形成并增強(qiáng)了S‐Sp4的形成。在LOC90024-KD細(xì)胞中獲得了相似的結(jié)果。 LOC90024 ORF和5′UTR‐ORF（5′U）（編碼SRSP）的過(guò)表達(dá)增加了L-Sp4的形成并減少了S-Sp4的形成，而LOC90024 5′UTR‐ORFmut（MUT）的過(guò)表達(dá)并沒(méi)有改變Sp4 premRNA的剪接。 我們用LOC90024 ORF，5'UTR-ORF（5'U）或5'UTR-ORFmut（MUT）載體在LOC90024 KO細(xì)胞中恢復(fù)了LOC90024的表達(dá)。 SRSP重新表達(dá)后，LOC90024 KO受損的Sp4外顯子3的內(nèi)含物恢復(fù)到對(duì)照水平，但LOC90024 lncRNA沒(méi)有恢復(fù)。 此外，SRSP不會(huì)改變Sp4 mRNA的總水平。 SRSF3的KD減弱了SRSP過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的Sp4外顯子3增加的包涵性。臨床腫瘤組織樣本中研究了Sp4 pre-mRNA剪接。 與匹配的相鄰非腫瘤組織相比，腫瘤組織中的L‐Sp4 mRNA水平升高而S‐Sp4 mRNA水平降低。臨床組織樣品中L‐Sp4水平與SRSP水平呈正相關(guān)，而S‐Sp4水平與SRSP水平呈負(fù)相關(guān)?？傮w而言，SRSP促進(jìn)了Sp4外顯子3的SRSF3依賴性包涵，以誘導(dǎo)L-p4形成并抑制S-Sp4形成。

    L-Sp4剪接變體編碼784-aa蛋白L-Sp4亞型，而不帶外顯子3的S-Sp4剪接變體由于幀偏移而編碼49-aa肽S-Sp4亞型。為了確定L-Sp4和S-Sp4在CRC腫瘤發(fā)生中的作用，我們恢復(fù)了Sp4-KD大腸癌細(xì)胞中抗Sp4 siRNA的L-Sp4或S-Sp4的表達(dá)。Sp4的KD可抑制HCT-116和SW480細(xì)胞的生長(zhǎng)、集落形成、遷移和侵襲。在重新表達(dá)L-Sp4后，HCT-116和SW480 CRC細(xì)胞中Sp4的KD誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)、集落形成、遷移和侵襲的減少可以有效地恢復(fù)到控制水平，表明L-Sp4亞型具有致癌功能，而S-Sp4亞型沒(méi)有致癌作用功能。

    為了研究SRSP是否促進(jìn)SRSF3與Sp4外顯子3的結(jié)合、Sp4外顯子3的包含以及通過(guò)與SRSF3的相互作用促進(jìn)細(xì)胞的腫瘤發(fā)生，在LOC90024 KO細(xì)胞中恢復(fù)野生型SRSP或SRSF3結(jié)合缺陷SRSPΔ16–22突變體的表達(dá)。當(dāng)SRSP中SRSP與SRSF3的結(jié)合區(qū)域被刪除時(shí)，SRSP沒(méi)有增加SRSF3與Sp4的E3（848–866）的結(jié)合。當(dāng)SRSP中SRSP與SRSF3的結(jié)合區(qū)域被刪除時(shí)，SRSP沒(méi)有誘導(dǎo)Sp4第3外顯子的包含以促進(jìn)L-Sp4剪接變體的形成。從功能上講，野生型SRSP的再表達(dá)有效地將LOC90024 KO誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)、菌落形成、遷移和侵襲的降低恢復(fù)到對(duì)照水平，而SRSF3結(jié)合缺陷SRSPΔ16–22突變體沒(méi)有。因此，這些結(jié)果表明，SRSP主要通過(guò)與SRSF3的相互作用促進(jìn)Sp4剪接和腫瘤發(fā)生。