飲食可通過(guò)翻譯后修飾影響小鼠腸道微生物蛋白質(zhì)組

    美國(guó)哈佛大學(xué)Wendy S. Garrett課題組發(fā)現(xiàn)，飲食可通過(guò)翻譯后修飾影響小鼠腸道微生物蛋白質(zhì)組，從而調(diào)節(jié)腎功能。相關(guān)論文于2020年9月18日發(fā)表在《科學(xué)》雜志上。
    慢性腎病的發(fā)病機(jī)制和治療一直未得到充分的研究。許多飲食微生物組研究都集中在膳食纖維、脂肪和碳水化合物的影響上。雖然有5%到10%的氨基酸會(huì)到達(dá)結(jié)腸，而結(jié)腸是腸道細(xì)菌代謝的主要部位，但人們對(duì)飲食中蛋白質(zhì)和氨基酸的具體作用知之甚少。在人類(lèi)中，增加膳食蛋白會(huì)增加腸道細(xì)菌產(chǎn)生H2S、吲哚和吲哚硫酸鹽。在慢性腎臟?。–KD）小鼠模型中，研究人員發(fā)現(xiàn)高硫氨基酸飲食會(huì)導(dǎo)微生物色氨酸酶活性的致翻譯后修飾。這降低了小鼠產(chǎn)生尿毒癥毒素的活性并改善了CKD的進(jìn)展。因此，飲食可以通過(guò)翻譯后修飾來(lái)調(diào)節(jié)微生物群的功能，從而促進(jìn)健康的宿主生理，而無(wú)需改變微生物群落組成。

    據(jù)了解，CKD與腸道菌群之間的關(guān)聯(lián)已被發(fā)現(xiàn)，但有關(guān)機(jī)制仍未解析。在人類(lèi)中，飲食蛋白會(huì)增加腸道細(xì)菌產(chǎn)生H2S、吲哚和吲哚酚硫酸鹽的能力。后者是尿毒癥毒素，H2S具有多種生理功能，其中某些功能是由翻譯后修飾介導(dǎo)的。
技術(shù)路線(xiàn)：

一、飲食中的Saa和腸道菌群調(diào)節(jié)CKD小鼠腎臟損傷的嚴(yán)重程度

    我們制定了等熱量的飲食來(lái)代表小鼠對(duì)含硫氨基酸（Saa）的極端消費(fèi)，與人類(lèi)的消費(fèi)相關(guān)，即低含量的蛋氨酸和半胱氨酸(參見(jiàn)表S1的飲食配方、材料和方法)，但有足夠的蛋氨酸，以避免蛋氨酸限制。
    與小鼠相比high-Saa +adenine ,specific-pathogenfree (SPF)小鼠低Saa +腺嘌呤(Saa +adenine )飲食有明顯增加血清肌酐水平(圖1),以及更廣泛和嚴(yán)重的腎皮質(zhì)組織病理變化,包括管狀擴(kuò)張和輟學(xué),和管周纖維化tubulitis,皮質(zhì)晶體沉積(圖1,B, D)。為了確定Saa的影響在多大程度上依賴(lài)于腸道菌群，我們將Saa+Ade飼料喂給生養(yǎng)的無(wú)菌種(GF)小鼠。與低saa +Ade日糧喂養(yǎng)的SPF小鼠相比，GF小鼠的血清肌酐和腎臟損傷明顯降低，且GF小鼠和高saa +Ade日糧喂養(yǎng)的SPF小鼠具有相似的表型(圖1,A至D)。高Saa飼料的SPF小鼠盲腸硫化物含量高于低Saa飼料的小鼠(圖1,E和F)。不管Saa飼料如何，GF小鼠ceca的硫化物含量顯著低于SPF小鼠(圖1,E和F)。進(jìn)一步分析PTRI全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)集加強(qiáng)了這一發(fā)現(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)CKD患者樣本中標(biāo)準(zhǔn)化大腸桿菌平均基因豐度高于非CKD對(duì)照(圖1G)。
在低saa +Ade飲食中，ASF小鼠被大腸桿菌(ASFE)定植。與ASF小鼠相比，大腸桿菌(coli)血清肌酐水平更高，更廣泛的小管炎、管狀萎縮和水腫、管周纖維化和皮質(zhì)結(jié)晶(圖1,H - K)。與SPF小鼠一樣，我們發(fā)現(xiàn)ASFE中盲腸硫化物含量更高。高、低saa +Ade飲食中的大腸桿菌小鼠(圖1、L和M)。
    總之，這些結(jié)果支持大腸桿菌與飲食中的Saa相互作用來(lái)調(diào)節(jié)腎功能
二、對(duì)大腸桿菌S-sulfhydrome 的表征表明TnaA是一種高度S-sulfhydrome 的蛋白質(zhì)

    在lead acetate 檢測(cè)試驗(yàn)中，無(wú)論喜氧或厭氧培養(yǎng)的大腸桿菌都能從半胱氨酸中以劑量依賴(lài)的方式產(chǎn)生硫化物，且不影響生長(zhǎng)(圖2A和圖S4, a至C)。decR的缺失導(dǎo)致硫化物產(chǎn)量顯著下降，但對(duì)生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)沒(méi)有影響(圖2,A和B;圖S4, A至D)。pulldown利用馬來(lái)酰亞胺與游離硫醇和過(guò)硫化物結(jié)合，產(chǎn)生硫醚鍵，并利用二硫蘇糖醇(DTT)破壞二硫鍵而不破壞硫醚鍵的能力(圖2,C)。我們觀察到，在添加半胱氨酸的培養(yǎng)基中，dtt洗脫的野生型大腸桿菌裂解液樣品中，s巰基化蛋白得到了穩(wěn)健的富集(圖2D)。相比之下，在添加半胱氨酸的LB肉湯中生長(zhǎng)的產(chǎn)生較少H2S的DdecR細(xì)菌的裂解液比WT大腸桿菌表現(xiàn)出更少的s -巰基化(圖2E)。我們?cè)噲D使用定量串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽(TMT)液相色譜多階段質(zhì)量分光光度(LC-MS3)分析來(lái)鑒定大腸桿菌的磺氫。該分析顯示，與未處理DTT的相同樣品相比，大多數(shù)被DTT洗脫的大腸桿菌裂解液中富集的蛋白質(zhì)確實(shí)是s -巰基化的(圖2F)。按q值對(duì)s -巰基化蛋白進(jìn)行排序(DTT與非DTT)，結(jié)果顯示了10個(gè)最豐富的s -巰基化蛋白(圖2F和圖S4G)。TnaA(圖2F)，一種催化色氨酸降解為吲哚、丙酮酸和氨的分泌酶，提供了我們的s -巰基分析和我們?cè)贑KD小鼠模型中觀察到的表型之間的潛在聯(lián)系。
三、硫水合抑制吲哚產(chǎn)生的大腸桿菌酶活性

    TnaA成為研究CKD小鼠模型中宿主微生物相互作用的一個(gè)有吸引力的目標(biāo)。我們將大腸桿菌的TnaA染色體復(fù)制替換為在其本地啟動(dòng)子下克隆的TnaA -his。然后，我們通過(guò)Western blot分析WT和DdecR E. coli裂解液中的TnaA s -巰基化反應(yīng)，驗(yàn)證了我們的s -巰基化結(jié)果，發(fā)現(xiàn)DdecR裂解液中的TnaA s -巰基化反應(yīng)降低(圖3A)。H2O2和NaHS處理的大腸桿菌裂解液TnaA s -硫酸化反應(yīng)分別減少和增加(圖3B)。細(xì)菌培養(yǎng)物L(fēng)C-MS/MS分析。我們發(fā)現(xiàn)，向LB肉湯中添加半胱氨酸或NaHS可以降低上清液中的吲哚濃度(圖3,C和D)。我們觀察到，與多硫化物供體四硫化二鈉(Na2S4)孵育可導(dǎo)致TnaA s -巰基化(圖S6D)和體外酶活性降低60%(圖3E)。作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，我們添加了DTT，可以將s -巰基化TnaA降低到其功能原生形態(tài)，我們觀察到TnaA活性增加了三倍以上(圖3E)。
    總之，這些結(jié)果表明無(wú)論是在體外還是在細(xì)菌培養(yǎng)中，通過(guò)色氨酸產(chǎn)生吲哚來(lái)檢測(cè)大腸桿菌TnaA的硫酸水合作用降低了它的活性。
四、在小鼠CKD模型中，膳食Saa調(diào)節(jié)盲腸吲哚水平、血清吲哚酰硫酸鹽水平和腎功能

    與低saa飲食的小鼠相比，高saa飲食的小鼠盲腸中TnaA s -巰基化含量更高(圖4A)。我們測(cè)量了兩種飲食下ASF大腸桿菌小鼠的盲腸內(nèi)吲哚含量。我們發(fā)現(xiàn)，高Saa飲食的小鼠吲哚水平顯著降低，這表明，高Saa飲食不僅增加了TnaA s -巰基化，而且這種修飾足以影響體內(nèi)TnaA的活性(圖4,B和C)。在大腸桿菌小鼠中，ASFtnaA mut小鼠的血清中未檢測(cè)到吲哚酰硫酸鹽，因?yàn)樵谀c道菌群中不存在色氨酸酶。由于大腸桿菌DdecR缺乏從半胱氨酸中生成硫化物，TnaA仍保持較少的硫化物化和較高的活性(圖S6A)。與觀察結(jié)果一致的是，ASFDdecR小鼠的盲腸硫化物減少(圖S7C)，盲腸吲哚增多(圖S7D)，血清吲哚基硫酸酯相對(duì)于ASFE增加。大腸桿菌小鼠(圖4D)。WT大腸桿菌定植的小鼠比tnaA mut菌株定植的小鼠血清肌酐水平更高(圖4E)。大腸桿菌DdecR與WT大腸桿菌相比，更嚴(yán)重的管間質(zhì)損傷、纖維化、皮質(zhì)晶體沉積和更廣泛的實(shí)質(zhì)受累的組織學(xué)結(jié)果反映了吲哚酰硫酸鹽和肌酐觀察到的趨勢(shì)(圖4,F, G)。
    總之，這些數(shù)據(jù)支持了飲食成分可以產(chǎn)生影響腸外宿主功能的腸道微生物蛋白的翻譯后修飾，也為宿主-飲食-微生物群的相互作用如何導(dǎo)致CKD等疾病狀態(tài)提供了機(jī)制上的見(jiàn)解。