NLRP3和鈣離子積累共同推進(jìn)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎進(jìn)程

    增加細(xì)胞外Ca2+濃度（[Ca2+] ex）在單核細(xì)胞內(nèi)通過鈣離子敏感受體（CaSR）驅(qū)動(dòng)激活NLRP3炎癥小體。但是在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的具體機(jī)制仍不清楚，本文對(duì)該機(jī)制進(jìn)行了深入探討，并挖掘出重要的代謝通路。本文在2020年8月25日發(fā)表在《Nature Communications》期刊上，其影響因子12.121。

研究結(jié)果：
1、[Ca2+] ex的增加導(dǎo)致鈣蛋白顆粒（CPPs）的形成
    為了探究鈣離子敏感受體（CaSR）驅(qū)動(dòng)的骨髓細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)致NLRP3依賴的IL-1β產(chǎn)量，構(gòu)建了CaSR敲除的單核細(xì)胞THP-1細(xì)胞系。如Fig. 1a所示，[Ca2+] ex誘導(dǎo)的IL-1β響應(yīng)在CaSR敲除的單核細(xì)胞THP-1細(xì)胞中被顯著抑制，而對(duì)ATP和尿酸一鈉(MSU)晶體的響應(yīng)不受影響。用小鼠外周血單核細(xì)胞進(jìn)行骨髓特異性CaSR敲除(B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo7jx-CaSRΔflox/Δflox)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這種CaSR效應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)，在5.6mM [Pi]ex存在的情況下，經(jīng)[Ca2+]ex刺激后，IL-1β分泌物分泌顯著減少(Fig.1b)。
    使用含有1-5.6mM的Pi的RPMI1640培養(yǎng)基，研究Pix對(duì)[Ca2 +] ex誘導(dǎo)的單核細(xì)胞中IL-1β釋放的影響，其中加入[Ca2 +]作為氯化鈣作用。在≥3mM的Piex下，[Ca2 +] ex觸發(fā)的IL-1β釋放增加具有濃度依賴性（Fig.1c）。在低Piex下沒有[Ca2 +] ex效應(yīng)，而且高Piex與低[Ca2 +] ex結(jié)合也不會(huì)誘導(dǎo)IL-1β釋放（Fig.1c）。如Fig.1d所示，CPPs只能在≥3mM的Pix情況下檢測(cè)到，且在沒有[Ca2 +]的情況下不形成鈣離子顆粒。孵育20小時(shí)后，CPPs的大小僅略有增加，與顆粒形成并行，由于Ca 2+在顆粒中的結(jié)合，[Ca 2+]逐漸降低，通過此過程，添加的Ca2 +會(huì)在20h內(nèi)完全用完（Fig.1e）。WB可以檢測(cè)到CPPs中確實(shí)存在胎球蛋白（Fig.1f），其顆粒形態(tài)為非晶體的，無固定性狀的，膠體結(jié)構(gòu)（Fig.1g和h）。電子顯微鏡與能量色散x射線能譜(EDX)結(jié)合揭示在最初的4小時(shí)內(nèi)，CPPs鈣和磷的含量大致相等。

Fig. 1 In the presence of [Pi] and fetuin-A, addition of [Ca2+] triggers calciprotein particle formation

    為了證實(shí)被[Ca2+]刺激的單核細(xì)胞中CPPs的存在，使用TEM和掃描透射電鏡(STEM)，可以看到靠近細(xì)胞表面的細(xì)胞外間隙中有電子致密顆粒，胞漿中也有(Fig. 2a, b)。顆粒的大小和元素組成與FBS補(bǔ)充的2.5mM [Ca2 +]的RPMI中檢測(cè)到的CPP相一致，EDX分析表明，這些顆粒含有大量的Ca2 +，表明它們的大小和組成與上述CPP確實(shí)相同（Fig.2c，d）。

Fig. 2 Uptake and elemental composition of intracellular calciprotein particles

2、CPPs被CaSR介導(dǎo)的大胞飲作用吸收
    增加[Ca2 +] ex刺激大胞飲作用，所以作者猜測(cè)自發(fā)形成的CPP可能被單核細(xì)胞吞噬由于[Ca2 +] ex誘導(dǎo)的CaSR信號(hào)，于是作者使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)單核細(xì)胞的大胞飲作用。如Fig.3a, b所示，單核細(xì)胞的大胞飲作用是以一種劑量依賴的方式受到[Ca2 +] ex調(diào)節(jié)，而不是依賴于[Pi]ex。此外，[Ca2 +] ex誘導(dǎo)的鈣離子大胞飲吸收是一個(gè)主動(dòng)耗能的過程，其37℃時(shí)的效果強(qiáng)烈，4℃時(shí)則被抑制，并且該過程可以通過細(xì)胞松弛素D或latrunculin A（兩種肌動(dòng)蛋白聚合抑制劑）預(yù)處理廢除掉（Fig.3c-e）。鑒于Calhex231和NPS2143，兩種CaSR的特異性負(fù)變構(gòu)調(diào)節(jié)器可以抑制單核細(xì)胞大胞飲作用，證實(shí)了[Ca2 +] ex誘導(dǎo)的單核細(xì)胞大胞飲作用確實(shí)是受到CaSR信號(hào)驅(qū)動(dòng)（Fig.3f）。
    為了確認(rèn)[Ca2 +] ex誘導(dǎo)的胞內(nèi)CPPs的攝取用共焦拉曼顯微鏡(CRM)對(duì)單核細(xì)胞進(jìn)行了實(shí)時(shí)成像(CRM, Fig. 3g, h)。CPPs在無細(xì)胞介質(zhì)中的拉曼光譜(Fig. 3h，左)顯示了與羥基磷灰石晶體顆粒高度相似的指紋圖譜。孵育60min后，CPPs在細(xì)胞膜附近被發(fā)現(xiàn)，并內(nèi)化在單核細(xì)胞中（Fig.3g）。從胞內(nèi)CPPs提取的拉曼光譜(Fig. 3h，右)顯示胞內(nèi)PO4 - 3振動(dòng)存在對(duì)稱的拉伸和彎曲模式。這些都證實(shí)了單核細(xì)胞中[Ca2 +] ex誘導(dǎo)的CPPs的被攝取進(jìn)入細(xì)胞。

Fig. 3 [Ca2+] ex induces macropinocytosis

    接下來，使用流式成像觀察大胞飲作用吸收CPPs通過將單核細(xì)胞與結(jié)合Ca2+的熒光染料共孵育。熒光圖中細(xì)胞內(nèi)鈣離子信號(hào)即表示CPPs的積累。如Fig.4a所示，2.5mM [Ca2+]ex驅(qū)動(dòng)單核細(xì)胞對(duì)CPPs的吸收，若沒有[Ca2+]ex則吸收量極少。當(dāng)使用另一種CaSR級(jí)聯(lián)的物質(zhì)鋇代替[Ca2+]ex的時(shí)候也能觀察到類似的CPPs吸收(Fig. 4b)。
    [Ca2+]ex誘導(dǎo)的和[Pi]ex誘導(dǎo)的響應(yīng)曲線顯示對(duì)照組細(xì)胞中添加1mM [Ca2+]時(shí)有快速的細(xì)胞反應(yīng)，在CaSR缺乏的THP-1細(xì)胞中響應(yīng)顯著降低(Fig. 4d)。然而，CaSR缺乏的細(xì)胞仍然對(duì)[Ca2+]的添加表現(xiàn)出一些反應(yīng)，很可能是由于CaSR的獨(dú)立作用。[Ca2+]ex誘導(dǎo)的和[Pi]ex誘導(dǎo)的動(dòng)態(tài)質(zhì)量重新分配(DMR)響應(yīng)顯示Ca2+加入后的30min開始二次緩慢增加，單核細(xì)胞DMR對(duì)增加的[Ca2+]ex的響應(yīng)受到[Pi]ex的與濃度相關(guān)的信號(hào)增強(qiáng)的影響(Fig. 4e)。

Fig. 4 Macropinocytosis of CPPs depends on CaSR signaling.

3、IL-1β被CPPs和[Ca2+]ex 觸發(fā)是不依賴[Pi]ex的
    為了探究CPPs在[Ca2+]ex 誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體激活中的作用，在低濃度[Pi]培養(yǎng)基中，在預(yù)先形成的CPPs存在的情況下，用[Ca2+]ex刺激單核細(xì)胞，以排除從頭形成CPPs的可能性。在2.5mM [Ca2+]ex存在的情況下結(jié)果發(fā)現(xiàn)CPPs可觸發(fā)濃度依賴性IL-1釋放，如果沒有進(jìn)一步的Ca2+添，CPPs對(duì)IL-1β釋放的影響很小(Fig. 5a)。單核細(xì)胞[Ca2+]誘導(dǎo)CPP攝取后IL-1β釋放的結(jié)果顯示，在有[Ca2+]ex存在的低[Pi]介質(zhì)中，CPP的形成在3小時(shí)后就開始了，并且比在有5.6 mM [Pi]存在的介質(zhì)中生產(chǎn)[Ca2+]的速度更快(Fig.5b)。Fig. c結(jié)果表明[Ca2+]ex 誘導(dǎo)的IL-1β釋放依賴于肌動(dòng)蛋白聚合。CA-074-Me的藥物組織蛋白酶B抑制降低了[Ca2+]誘導(dǎo)的IL-1β抗氧化反應(yīng)，該結(jié)果進(jìn)一步支持了被吞噬的CPPs的溶酶體消化有助于[Ca2+]ex誘導(dǎo)的炎癥小體激活和單核細(xì)胞中IL-1β釋放(Fig. 5d)。過濾掉大顆粒CPPs后，[Ca2+]ex誘導(dǎo)的IL-1β釋放顯著下降，說明CPPs的大小和濃度與炎癥小體的激活有關(guān)(Fig. 5e)。當(dāng)通過增加培養(yǎng)基中的胎球蛋白-A濃度來增加顆粒生成過程中胎球蛋白-A和[Ca2 +]的比例時(shí)，觀察到濃度依賴性的IL-1β釋放降低（圖5f）。 添加PFA抑制了[Ca2 +]濃度依賴誘導(dǎo)的IL-1β釋放（圖5g）?？傊?，上述結(jié)果表明[Ca2 +]攝取后形成CPPs會(huì)誘導(dǎo)炎癥小體激活I(lǐng)L-1β釋放，且具有濃度依賴性。

Fig. 5 [Ca2+]ex mediated calciprotein particle uptake mediates inflammasome activation

4、[Ca2+]ex誘導(dǎo)的IL-1β釋放在RA中是增加的
    為了進(jìn)一步證實(shí)體內(nèi)炎癥與對(duì)[Ca2 +] ex和CPPs反應(yīng)之間的聯(lián)系，作者進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)[Ca2+]ex增加的幾次導(dǎo)致RA單核細(xì)胞的IL-1β釋放高于健康供體(Fig. 6a)，并且無疾病緩解性抗風(fēng)濕藥（DMARD）的RA患者在用[Ca2 +] ex刺激后產(chǎn)生更高的IL-1β濃度。 除了IL-1β，與健康供體相比，在用[Ca2 +] ex刺激后，RA單核細(xì)胞還釋放了更高濃度的IL-1α和IL-18（Fig. 6b，c）。DMARD的RA患者在用[Ca2+] ex刺激后產(chǎn)生更高的IL-1β濃度。 除了IL-1β，與健康供體相比，在用[Ca2+] ex刺激后，RA單核細(xì)胞還釋放了更高濃度的IL-1α和IL-18（Fig.b，c）。與來自健康供體的單核巨噬細(xì)胞相比，當(dāng)單核巨噬細(xì)胞在體外從RA單核細(xì)胞分化時(shí)，在[Ca2+]ex刺激后，它們也表現(xiàn)出更高的IL-1鉀離子濃度(Fig. 6e)。較高比例的RA單核細(xì)胞內(nèi)化鈣素染色表明它們?cè)黾拥膬A向是響應(yīng)[Ca2+]ex，但只對(duì)LPS刺激響應(yīng)（Fig. 6f）。Fig. 6g證實(shí)RA中[Ca2+]ex誘導(dǎo)的IL-1β釋放和CPPs攝取導(dǎo)致可能是因?yàn)镃aSR信號(hào)的增加導(dǎo)致的。

Fig. 6 Increased [Ca2+]ex-induced, CPP-dependent inflammasome activation in RA.

    為了研究溶酶體滲漏是否有助于[Ca2+]ex誘導(dǎo)的NLRP3炎性小體活化，將溶酶體用stain啶橙染色，并在存在5.6mM Pi的情況下用2.5mM Ca2 +刺激，或用MSU晶體或溶酶體破壞劑刺激L-亮氨酰-L-亮氨酸甲酯（LLOMe）作為陽性對(duì)照。成像流式細(xì)胞儀顯示，與陰性對(duì)照相比，用[Ca2+]ex刺激后，溶酶體膜的完整性沒有改變（Fig. 7a）。 相比之下，MSU晶體和LLOMe誘導(dǎo)了溶酶體滲漏，由孵育4小時(shí)后明亮細(xì)節(jié)熒光強(qiáng)度顯著降低所表明。RA單核細(xì)胞與健康供體之間的溶酶體滲漏比較沒有顯示差異（Fig. 7a）。
    通常認(rèn)為炎癥小體激活和隨后的IL-1β釋放與細(xì)胞焦亡或炎性細(xì)胞死亡有關(guān)，這促使我們研究細(xì)胞存活。流式細(xì)胞儀（Fig. 7b，c）和標(biāo)準(zhǔn)LDH釋放測(cè)定（Fig. 7d）分析的碘化丙啶（PI）/ Hoechst染色均表明，在發(fā)生IL-1β釋放的條件下，細(xì)胞死亡增加。來自RA患者的單核細(xì)胞在單獨(dú)用LPS刺激后顯示出增加的細(xì)胞存活率，但由[Ca2+]ex或ATP誘導(dǎo)的單細(xì)胞死亡率與健康供體無差異（Fig. 7d）。在上述健康的供體中，在升高的[Ca2 +]/Pi條件下細(xì)胞死亡率與相應(yīng)的IL-1β釋放密切相關(guān)（Fig. 7e）。細(xì)胞死亡部分取決于NLRP3（Fig. 7f）和CaSR（Fig. 7g）的存在。結(jié)果表明，抑制CaSR介導(dǎo)的CPP攝取或抑制溶酶體CPP分解可顯著抑制細(xì)胞死亡(Fig.7h)?？傊?，CaSR介導(dǎo)的CPP攝取誘導(dǎo)的炎癥小體激活和隨后的IL-1β釋放與細(xì)胞死亡有關(guān)。

Fig. 7 [Ca2+]ex-induced CPP uptake in monocytes does not induce lysosomal leakage.

5、[Ca2+]ex誘導(dǎo)的IL-1β釋放作用于局部炎癥
    接下來，研究了關(guān)節(jié)炎對(duì)[Ca2 +]和[Ca2 +] ex誘導(dǎo)的IL-1β分泌的影響。RA患者的滑液樣本中[Ca2 +]濃度高于骨關(guān)節(jié)炎或非侵蝕性關(guān)節(jié)疾病患者的關(guān)節(jié)積液（Fig.8a）。此外，與骨關(guān)節(jié)炎樣品相比，在RA患者的滑膜襯里層中發(fā)現(xiàn)CaSR表達(dá)上調(diào)（Fig.8c）。為了研究CaSR在體內(nèi)關(guān)節(jié)炎中的作用，將變構(gòu)CaSR調(diào)節(jié)劑R568用于DBA / 1J小鼠的膠原蛋白抗體誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎（CAIA）模型中。圖8d所示的結(jié)果表明，在該小鼠模型中，CaSR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的正調(diào)節(jié)加重了關(guān)節(jié)炎。
    為了進(jìn)一步研究[Ca2 +]在糜爛性關(guān)節(jié)炎中的作用，首先，從外周血，骨髓和腹膜腔中分離CD11b +單核細(xì)胞，以確認(rèn)糜爛性關(guān)節(jié)炎與單核細(xì)胞IL-1β對(duì)[Ca2 +] ex升高的反應(yīng)之間的聯(lián)系。在所有研究的細(xì)胞群中，與對(duì)照小鼠相比，CIA小鼠的細(xì)胞顯示出更強(qiáng)的[Ca2 +] ex誘導(dǎo)的IL-1β反應(yīng)（Fig.8e）。切片顯示鈣紅染色在骨侵蝕部位和軟骨剝奪的關(guān)節(jié)表面呈陽性染色（Fig.8f）。因此，通過從股骨中清除骨髓并測(cè)量這些骨髓潮紅中的[Ca2 +]來確定CIA中骨骼中Ca2 +的釋放。與對(duì)照小鼠相比，關(guān)節(jié)炎DBA / 1J小鼠的髓內(nèi)[Ca2 +]顯著增加（Fig.8g），這表明Ca2 +從CIA的骨基質(zhì)中釋放的增加。 [Ca2 +] ex誘導(dǎo)的IL-1β釋放與骨髓潮紅中確定的[Ca2 +]量（Fig.8h）和CIA評(píng)分確定的關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度（Fig.8i）相關(guān)。

Fig. 8 Bone erosion in arthritis leads to locally increased [Ca2+] and elevated IL-1β secretion.

    總之，本文發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞通過大胞飲作用吞噬CPPs，并且此過程嚴(yán)格取決于[Ca2 +] ex的增加觸發(fā)的CaSR信號(hào)傳導(dǎo)。CPP的巨胞飲作用增強(qiáng)，導(dǎo)致溶酶體活性增加，NLRP3炎性體激活和IL-1β釋放。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）中的單核細(xì)胞響應(yīng)CaSR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)顯示CPP攝取增加和IL-1β釋放。這些單核細(xì)胞和受累關(guān)節(jié)中局部[Ca2 +]誘導(dǎo)的CaSR表達(dá)增加，可能有助于這種增強(qiáng)的炎癥反應(yīng)。CaSR介導(dǎo)的NLRP3炎性小體活化不僅在RA中而且在其他炎性疾病中也可引起炎性關(guān)節(jié)炎和全身性炎癥。抑制CaSR介導(dǎo)的CPP攝取可能是治療RA的治療方法。
參考文獻(xiàn)：
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