腫瘤抑制因子ZDHHC1

    由于缺乏高效的預防和治療措施，癌癥正威脅著我們每個人的健康，在全球范圍內留下了沉重的健康負擔。盡管癌癥歷來被認為是一種以細胞不斷增殖和侵襲/轉移為特征的細胞生物學疾病，但最近提出的證據(jù)表明，它也應被視為一種代謝性疾病。近期，重慶醫(yī)科大學向廷秀教授課題組發(fā)現(xiàn)ZDHHC1是一種潛在的腫瘤抑制因子，由于啟動子甲基化而經常被沉默，能夠負調節(jié)腫瘤細胞的代謝，同時通過刺激氧化應激和內質網(wǎng)應激誘導細胞焦亡和凋亡加速細胞死亡，可用于開發(fā)新的癌癥預防和療法。相關研究以“DNA methylation downregulated ZDHHC1 suppresses tumor growth by altering cellular metabolism and inducing oxidative/ER stress-mediated apoptosis and pyroptosis”為題發(fā)表在Theranostics雜志上，雜志影響因子8.579。
技術路線：

結果：
1.ZDHHC1在腫瘤中的表達特征
    作者發(fā)現(xiàn)ZDHHC1在正常的成人和胎兒組織中廣泛表達（A），但在一些癌細胞系中沉默或表達下調（B），并通過甲基化特異性PCR（MSP）發(fā)現(xiàn)ZDHHC1啟動子發(fā)生了甲基化（C）。

    進一步研究發(fā)現(xiàn)在ZDHHC1缺失的細胞中，去甲基化處理后檢測到ZDHHC1重新表達（A）；亞硫酸氫鹽基因組測序（BGS）實驗表明ZDHHC1陰性細胞系的啟動子區(qū)域攜帶大量的甲基化CpG位點，若細胞被去甲基化劑處理致使這些位點被去甲基化（B），且發(fā)現(xiàn)表達ZDHHC1的MB468, HCT116和A549細胞中ZDHHC1沒有甲基化（C）。通過MSP和BGS檢測結腸癌、肝細胞癌、鼻咽癌、胃癌、乳腺癌和肺癌的腫瘤和鄰近正常組織中ZDHHC1啟動子甲基化發(fā)現(xiàn)，與鄰近的正常組織相比，腫瘤樣本的啟動子有明顯的甲基化趨勢（D-E）。這些結果表明，ZDHHC1在腫瘤中的表達經常通過啟動子的甲基化被沉默。

2.ZDHHC1在腫瘤中的作用
    作者通過RT-PCR和WB實驗證實了穩(wěn)定轉染在ZDHHC1陰性癌細胞系（HONE1和MCF7細胞系）中異位表達ZDHHC1的有效（A），并通過CCK-8和克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)ZDHHC1可以抑制細胞增殖(B，C)。細胞周期分析顯示ZDHHC1表達導致HONE1細胞阻滯于G0/G1期，而MCF7細胞聚集在G2/M期（D），這可能是由于細胞類型特異性的差異，進一步通過Annexin V-FITC染色和透射電鏡實驗發(fā)現(xiàn)ZDHHC1表達誘導MCF7和HONE1細胞凋亡，且transwell和傷口愈合試驗發(fā)現(xiàn)ZDHHC1抑制細胞遷移和侵襲（F，G）。體外驗證了ZDHHC1的抑癌作用，作者接下來在裸鼠異種移植瘤模型中驗證ZDHHC1的抑癌作用，發(fā)現(xiàn)轉染ZDHHC1表達細胞的腫瘤重量和體積顯著下降（H-J），免疫組化表明Ki67和PCNA的表達明顯下降，而TUNEL染色顯示ZDHHC1組異種移植切片的凋亡水平升高（K，L）,WB實驗揭示了在ZDHHC1表達的異種移植瘤中，caspase- 3,7和PARP表達均上調（M）?？傊琙DHHC1在體內外發(fā)揮抑制癌細胞增殖、誘導癌細胞凋亡和抑制癌細胞遷移和侵襲的能力，這通常是腫瘤細胞中腫瘤抑制基因的關鍵特征。

3.ZDHHC1對EMT和干細胞特性的影響
    作者發(fā)現(xiàn)ZDHHC1表達的細胞更容易緊密粘在一起，類似于間充質-上皮轉變（A），且通過免疫熒光和WB檢測到ZDHHC1表達上調了上皮標志物E-cadherin和Occludin的表達，下調了間質標志物Vimentin和N-cadherin的表達（B，C），進一步檢測了6個腫瘤干細胞特性關鍵生物標志物的表達，發(fā)現(xiàn)NANOG、SOX2、OCT4、CD44、ABCG2和BMI1在ZDHHC1過表達細胞中表達下降（D），球體形成實驗中ZDHHC1降低了癌細胞的球體形成率（E，F(xiàn)）。以上說明ZDHHC1作為一種腫瘤抑制因子，在人類癌癥中抑制EMT和細胞干細胞特性。

4.ZDHHC1在腫瘤中的調控機制
    作者通過RT-qPCR測定轉染siRNA-CYGB的細胞中CYGB沉默效率（A）, 轉染siRNA-CYGB導致ZDHHC1表達下調、GLUT1和HXK2表達上調，而ZDHHC1表達降低了GLUT1和HXK2表達水平，且在ZDHHC1-HONE1細胞中沉默 CYGB可部分逆轉GLUT1和HXK2的表達（B-D）。挽救實驗證實了沉默CYGB可以部分逆轉ZDHHC1過表達抑制癌細胞系增殖和誘導凋亡的能力（E-G）。特異性試劑盒測定活性氧(ROS)、超氧化物(O2-)含量、NADP+/NADPH比值和總抗氧化能力（TAC）顯示ZDHHC1表達細胞中ROS、O2-含量以及NADP+/NADPH比值增加，而TAC水平無顯著變化（H-K），且發(fā)現(xiàn)ZDHHC1上調了幾個被認為是內質網(wǎng)應激和未折疊蛋白反應（UPR）途徑關鍵靶基因，且核苷酸結合寡聚化結構域樣受體家族、NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的mRNA和蛋白水平升高（L-M）。此外，透射電鏡顯示表達ZDHHC1的細胞表現(xiàn)出焦亡形態(tài)：膜完整性降低、細胞腫脹和裂解（N），免疫染色發(fā)現(xiàn)ZDHHC1過表達細胞的異種移植裸鼠腫瘤組織中MLKL的表達明顯更高（O）。綜上所述，ZDHHC1至少部分通過CYGB介導的葡萄糖代謝途徑抑制癌細胞的葡萄糖代謝，并通過介導氧化應激和內質網(wǎng)應激反應誘導細胞焦亡。

5.ZDHHC1對氧化應激和內質網(wǎng)應激的影響
    作者用氧化應激抑制劑ALA和內質網(wǎng)應激抑制劑4-PBA處理有或無ZDHHC1表達的HONE1細胞，發(fā)現(xiàn)內質網(wǎng)應激和焦亡標志物GRP78、CHOP、NLRP3和IL-1β表達明顯下降，且LPS+ATP誘導細胞焦亡后ZDHHC1組的相關指標上調（A，B），GSDMD和GSDME的水平顯著增加（C）。在HONE1細胞中異位表達野生型或突變的ZDHHC1(C164A)，發(fā)現(xiàn)NLRP3可被ZDHHC1上調，但不能被ZDHHC1 C164A上調（D，E）。以上數(shù)據(jù)說明ZDHHC1誘導的細胞毒性至少部分通過介導氧化應激和內質網(wǎng)應激信號通路參與細胞焦亡和細胞凋亡。

結論：
    總之，癌細胞系和多種腫瘤組織中通過DNA甲基化下調ZDHHC1的表達，且CYGB對于ZDHHC1在癌細胞中作為腫瘤抑制因子的功能至關重要，證實了ZDHHC1介導氧化應激和內質網(wǎng)應激刺激焦亡，從而增加癌細胞凋亡。
參考文獻：
Xin Le, Junhao Mu, Weiyan Peng，et al. DNA methylation downregulated ZDHHC1 suppresses tumor growth by altering cellular metabolism and inducing oxidative/ER stress-mediated apoptosis and pyroptosis. Theranostics. 2020, 10(21): 9495-9511.