腫瘤抑制因子ZDHHC1

    由于缺乏高效的預(yù)防和治療措施，癌癥正威脅著我們每個(gè)人的健康，在全球范圍內(nèi)留下了沉重的健康負(fù)擔(dān)。盡管癌癥歷來(lái)被認(rèn)為是一種以細(xì)胞不斷增殖和侵襲/轉(zhuǎn)移為特征的細(xì)胞生物學(xué)疾病，但最近提出的證據(jù)表明，它也應(yīng)被視為一種代謝性疾病。近期，重慶醫(yī)科大學(xué)向廷秀教授課題組發(fā)現(xiàn)ZDHHC1是一種潛在的腫瘤抑制因子，由于啟動(dòng)子甲基化而經(jīng)常被沉默，能夠負(fù)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的代謝，同時(shí)通過(guò)刺激氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡和凋亡加速細(xì)胞死亡，可用于開發(fā)新的癌癥預(yù)防和療法。相關(guān)研究以“DNA methylation downregulated ZDHHC1 suppresses tumor growth by altering cellular metabolism and inducing oxidative/ER stress-mediated apoptosis and pyroptosis”為題發(fā)表在Theranostics雜志上，雜志影響因子8.579。
技術(shù)路線：

結(jié)果：
1.ZDHHC1在腫瘤中的表達(dá)特征
    作者發(fā)現(xiàn)ZDHHC1在正常的成人和胎兒組織中廣泛表達(dá)（A），但在一些癌細(xì)胞系中沉默或表達(dá)下調(diào)（B），并通過(guò)甲基化特異性PCR（MSP）發(fā)現(xiàn)ZDHHC1啟動(dòng)子發(fā)生了甲基化（C）。

    進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在ZDHHC1缺失的細(xì)胞中，去甲基化處理后檢測(cè)到ZDHHC1重新表達(dá)（A）；亞硫酸氫鹽基因組測(cè)序（BGS）實(shí)驗(yàn)表明ZDHHC1陰性細(xì)胞系的啟動(dòng)子區(qū)域攜帶大量的甲基化CpG位點(diǎn)，若細(xì)胞被去甲基化劑處理致使這些位點(diǎn)被去甲基化（B），且發(fā)現(xiàn)表達(dá)ZDHHC1的MB468, HCT116和A549細(xì)胞中ZDHHC1沒有甲基化（C）。通過(guò)MSP和BGS檢測(cè)結(jié)腸癌、肝細(xì)胞癌、鼻咽癌、胃癌、乳腺癌和肺癌的腫瘤和鄰近正常組織中ZDHHC1啟動(dòng)子甲基化發(fā)現(xiàn)，與鄰近的正常組織相比，腫瘤樣本的啟動(dòng)子有明顯的甲基化趨勢(shì)（D-E）。這些結(jié)果表明，ZDHHC1在腫瘤中的表達(dá)經(jīng)常通過(guò)啟動(dòng)子的甲基化被沉默。

2.ZDHHC1在腫瘤中的作用
    作者通過(guò)RT-PCR和WB實(shí)驗(yàn)證實(shí)了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染在ZDHHC1陰性癌細(xì)胞系（HONE1和MCF7細(xì)胞系）中異位表達(dá)ZDHHC1的有效（A），并通過(guò)CCK-8和克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ZDHHC1可以抑制細(xì)胞增殖(B，C)。細(xì)胞周期分析顯示ZDHHC1表達(dá)導(dǎo)致HONE1細(xì)胞阻滯于G0/G1期，而MCF7細(xì)胞聚集在G2/M期（D），這可能是由于細(xì)胞類型特異性的差異，進(jìn)一步通過(guò)Annexin V-FITC染色和透射電鏡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ZDHHC1表達(dá)誘導(dǎo)MCF7和HONE1細(xì)胞凋亡，且transwell和傷口愈合試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ZDHHC1抑制細(xì)胞遷移和侵襲（F，G）。體外驗(yàn)證了ZDHHC1的抑癌作用，作者接下來(lái)在裸鼠異種移植瘤模型中驗(yàn)證ZDHHC1的抑癌作用，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染ZDHHC1表達(dá)細(xì)胞的腫瘤重量和體積顯著下降（H-J），免疫組化表明Ki67和PCNA的表達(dá)明顯下降，而TUNEL染色顯示ZDHHC1組異種移植切片的凋亡水平升高（K，L）,WB實(shí)驗(yàn)揭示了在ZDHHC1表達(dá)的異種移植瘤中，caspase- 3,7和PARP表達(dá)均上調(diào)（M）?？傊琙DHHC1在體內(nèi)外發(fā)揮抑制癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡和抑制癌細(xì)胞遷移和侵襲的能力，這通常是腫瘤細(xì)胞中腫瘤抑制基因的關(guān)鍵特征。

3.ZDHHC1對(duì)EMT和干細(xì)胞特性的影響
    作者發(fā)現(xiàn)ZDHHC1表達(dá)的細(xì)胞更容易緊密粘在一起，類似于間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)變（A），且通過(guò)免疫熒光和WB檢測(cè)到ZDHHC1表達(dá)上調(diào)了上皮標(biāo)志物E-cadherin和Occludin的表達(dá)，下調(diào)了間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin和N-cadherin的表達(dá)（B，C），進(jìn)一步檢測(cè)了6個(gè)腫瘤干細(xì)胞特性關(guān)鍵生物標(biāo)志物的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NANOG、SOX2、OCT4、CD44、ABCG2和BMI1在ZDHHC1過(guò)表達(dá)細(xì)胞中表達(dá)下降（D），球體形成實(shí)驗(yàn)中ZDHHC1降低了癌細(xì)胞的球體形成率（E，F(xiàn)）。以上說(shuō)明ZDHHC1作為一種腫瘤抑制因子，在人類癌癥中抑制EMT和細(xì)胞干細(xì)胞特性。

4.ZDHHC1在腫瘤中的調(diào)控機(jī)制
    作者通過(guò)RT-qPCR測(cè)定轉(zhuǎn)染siRNA-CYGB的細(xì)胞中CYGB沉默效率（A）, 轉(zhuǎn)染siRNA-CYGB導(dǎo)致ZDHHC1表達(dá)下調(diào)、GLUT1和HXK2表達(dá)上調(diào)，而ZDHHC1表達(dá)降低了GLUT1和HXK2表達(dá)水平，且在ZDHHC1-HONE1細(xì)胞中沉默 CYGB可部分逆轉(zhuǎn)GLUT1和HXK2的表達(dá)（B-D）。挽救實(shí)驗(yàn)證實(shí)了沉默CYGB可以部分逆轉(zhuǎn)ZDHHC1過(guò)表達(dá)抑制癌細(xì)胞系增殖和誘導(dǎo)凋亡的能力（E-G）。特異性試劑盒測(cè)定活性氧(ROS)、超氧化物(O2-)含量、NADP+/NADPH比值和總抗氧化能力（TAC）顯示ZDHHC1表達(dá)細(xì)胞中ROS、O2-含量以及NADP+/NADPH比值增加，而TAC水平無(wú)顯著變化（H-K），且發(fā)現(xiàn)ZDHHC1上調(diào)了幾個(gè)被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）途徑關(guān)鍵靶基因，且核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族、NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的mRNA和蛋白水平升高（L-M）。此外，透射電鏡顯示表達(dá)ZDHHC1的細(xì)胞表現(xiàn)出焦亡形態(tài)：膜完整性降低、細(xì)胞腫脹和裂解（N），免疫染色發(fā)現(xiàn)ZDHHC1過(guò)表達(dá)細(xì)胞的異種移植裸鼠腫瘤組織中MLKL的表達(dá)明顯更高（O）。綜上所述，ZDHHC1至少部分通過(guò)CYGB介導(dǎo)的葡萄糖代謝途徑抑制癌細(xì)胞的葡萄糖代謝，并通過(guò)介導(dǎo)氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。

5.ZDHHC1對(duì)氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響
    作者用氧化應(yīng)激抑制劑ALA和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA處理有或無(wú)ZDHHC1表達(dá)的HONE1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和焦亡標(biāo)志物GRP78、CHOP、NLRP3和IL-1β表達(dá)明顯下降，且LPS+ATP誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡后ZDHHC1組的相關(guān)指標(biāo)上調(diào)（A，B），GSDMD和GSDME的水平顯著增加（C）。在HONE1細(xì)胞中異位表達(dá)野生型或突變的ZDHHC1(C164A)，發(fā)現(xiàn)NLRP3可被ZDHHC1上調(diào)，但不能被ZDHHC1 C164A上調(diào)（D，E）。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明ZDHHC1誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性至少部分通過(guò)介導(dǎo)氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路參與細(xì)胞焦亡和細(xì)胞凋亡。

結(jié)論：
    總之，癌細(xì)胞系和多種腫瘤組織中通過(guò)DNA甲基化下調(diào)ZDHHC1的表達(dá)，且CYGB對(duì)于ZDHHC1在癌細(xì)胞中作為腫瘤抑制因子的功能至關(guān)重要，證實(shí)了ZDHHC1介導(dǎo)氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激刺激焦亡，從而增加癌細(xì)胞凋亡。
參考文獻(xiàn)：
Xin Le, Junhao Mu, Weiyan Peng，et al. DNA methylation downregulated ZDHHC1 suppresses tumor growth by altering cellular metabolism and inducing oxidative/ER stress-mediated apoptosis and pyroptosis. Theranostics. 2020, 10(21): 9495-9511.