METL14-胰腺癌發(fā)展的靶點

胰腺癌是人類最致命的癌癥之一。N6甲基腺苷（m6A）是一種常見的真核細胞mRNA修飾，在生理和病理過程中起著重要作用。然而，它在胰腺癌中的作用仍不清楚。今天小編為大家介紹一篇影響因子為15.302，發(fā)表于“Molecular Cancer”上的文章“Upregulation of METTL14 mediates the elevation of PERP mRNA N6 adenosine methylation promoting the growth and metastasis of pancreatic cancer”。在本文中，我們發(fā)現 METTL14的上調可以通過m6A修飾降低PERP水平，促進胰腺癌的生長和轉移，因此METTL14是其治療的潛在靶點。

技術路線：

 結果：

1）胰腺癌中m6A修飾水平升高

我們測量了胰腺癌細胞系和人胰腺癌組織標本中m6A的水平。值得注意的是，與人胰腺導管上皮（HPDE）細胞和正常胰腺組織相比，七種胰腺癌細胞系中有五種細胞系的m6A水平升高（圖1a）。類似地，大約70%的胰腺癌組織中m6A水平高于配對的相鄰組織（圖1b）。此外，還分析了m6A水平與臨床病理學的關系。總體生存率低與m6A水平增高顯著相關（圖1c），且與腫瘤表達水平低的患者相比，m6A表達水平較高的腫瘤患者淋巴轉移顯著增加（圖1d）。

2）METTL14在胰腺癌中的異常表達

為了闡明胰腺癌中m6A水平升高的分子機制，我們評估了成對癌組織和鄰近組織樣本中最重要的m6A調節(jié)因子（METTL3、METTL14和WTAP）的表達。值得注意的是，實時PCR顯示，與鄰近的健康組織相比，胰腺癌組織中的METTL3、METTL14和WTAP上調（圖2a）。Western blot顯示，與正常組織相比，胰腺癌組織中METTL3 METTL14和WTAP水平顯著升高。（圖2b）。然而，在復雜成分中，只有METTL14水平與患者生存率顯著相關（圖2c）：METTL14水平升高與整體生存率差相關（圖2c）?？傊?，這些數據表明METTL14是一個主要的m6A調節(jié)因子，參與胰腺癌的臨床病理學。

3）METTL14上調促進胰腺癌生長和轉移

為了評估METTL14在胰腺癌中的生物學作用，我們在人類胰腺癌細胞系中過表達或敲除METTL14。METTL14的缺失顯著降低了m6A的水平（圖2d）。METTL14基因敲除顯著抑制PANC-1和MIA-PaCa-2細胞的增殖和集落形成，而METTL14的異位表達增加了PANC-1和BxPC-3細胞的增殖和集落形成（圖3a，b）。在裸鼠皮下和原位移植模型中，METTL14表達的增加促進了腫瘤的生長。相反，在這些模型中，METTL14的耗竭有效地抑制了腫瘤的生長（圖3c，d）。這些觀察結果表明METTL14在體內外均能促進胰腺癌的生長。

接下來，我們研究了METTL14在胰腺癌侵襲和轉移中的作用。細胞遷移分析顯示METTL14的缺失降低了PANC-1和MIA-PaCa-2細胞的遷移和侵襲性，而過表達METTL14對PANC-1和BXPC-3細胞的作用則相反（圖3e）。在創(chuàng)傷愈合分析中獲得了類似的遷移數據（圖3f）。我們用三種小鼠模型進一步研究了體內轉移。在皮下植入模型中，我們觀察到METTL14缺失或過表達分別顯著減少或增加淋巴轉移（圖3g）。在原位移植模型中，METTL14的過表達顯著加速了胰腺細胞向肝臟的轉移，而METTL14的耗竭減少了肝轉移（圖3h）。此外，在小鼠肝轉移模型中，METTL14的過表達導致肝轉移顯著增加并降低總生存率，而METTL14的耗竭減少了微轉移的數量并延長了生存期（圖3i）。這些數據表明METTL14在胰腺癌的生長和轉移中起著重要的促進作用。

4）利用RNA-Seq和m6A-Seq識別METTL14下游靶標

為了研究METTL14在胰腺癌中的調控作用，我們采用RNA-Seq分析PANC-1細胞、對照細胞和METTL14缺失細胞的基因表達譜。我們觀察到，在METTL14基因敲除后，564個基因上調，715個基因下調（圖4a）。 接著，我們使用m6A-Seq來繪制PANC-1細胞中具有生理（shCtrl）和降低（shMETTL14）METTL14水平的m6A甲基體。與我們之前的數據一致，在對照和METTL14敲除細胞中，GGACU基序在m6A位點高度富集（圖4b）。我們鑒定出2225和1124個m6A修飾轉錄本的8238和7820個m6A峰，其中來自1564和463轉錄本的7496和7078個峰分別在對照細胞和METT L14敲除細胞中是唯一的（圖4c，d）。為了評估基因表達的改變是否是METTL14介導的甲基化（尤其是m6A）的結果，我們比較了來自RNA序列和m6A序列的數據。RNA序列鑒定出80個上調基因和108個下調基因顯示m6A修飾，包括前6個水平升高的基因：EDN1、GNAL、DNAH11、ASS1、PERP、和YIPF6（圖4e）。

5）PERP是胰腺癌重要的METTL14靶基因

為了進一步研究METTL14靶基因，我們驗證了由RNA Seq和m6A-Seq鑒定的6個上調的基因在METTL14缺失的PANC-1細胞中的表達。在這些靶點中，PERP mRNA和蛋白質水平在METTL14缺失時增加（圖5a，b）。為了證實PERP基因經過METTL14介導的m6A修飾，我們進行了甲基化RNA免疫沉淀定量PCR（MeRIP-PCR）。這些結果也表明METTL14可以使PERP基因甲基化（圖5c）。在使用轉錄抑制劑放線菌素D處理后，METTL14基因敲除導致PERP轉錄半衰期顯著增加（圖5d）。通過分析我們從shMETTL14細胞獲得的m6A序列數據以及從三個獨立的m6A數據庫（SRAMP、RMBase和m6Avar）檢索到的附加信息，我們確定PERP的3’-UTR中的一個唯一峰是METTL14的潛在靶點。用PERP 3’-UTR報告熒光素酶檢測發(fā)現，METTL14的敲除大大提高了攜帶野生型PERP 3’-UTR的結構體的熒光素酶活性，而METTL14的過表達顯著降低了攜帶野生型PERP 3’-UTR的結構體的熒光素酶活性。（圖5e）。為了進一步研究PERP和METTL14表達之間的關系，我們在胰腺癌組織中進行了免疫熒光分析，觀察到高表達METTL14的腫瘤細胞顯示PERP低表達，反之亦然（圖5f）。

此外，作為m6A的第一個特征reader，YT521-B同源域家族（YTH）蛋白質調節(jié)mRNA的穩(wěn)定性和翻譯。為了確定YTHDF2是否是PERP m6A甲基化的潛在讀取器，我們敲除了YTHDF2，并觀察到在胰腺細胞中PERP表達顯著增強（圖5g）。YTHDF2基因敲除不僅增加了PERP mRNA的水平和穩(wěn)定性，而且在METTL14過表達的情況下也消除了它們的降低（圖5h，i）。這些結果表明PERP是METTL14的直接靶點，以m6A依賴的方式調節(jié)METTL14-YTHDF2-PERP軸。

 


6）PERP與METTL14誘導胰腺癌細胞生長和侵襲有關

為了了解PERP在METTL14誘導胰腺癌生長中的作用，我們在METTL14缺失的胰腺癌細胞中敲除PERP。我們發(fā)現PERP的耗竭顯著提高了PANC-1細胞的活力和集落形成，但也消除了METTL14基因敲除后其下降的趨勢（圖6a，b）。此外，transwell檢測結果顯示，PERP敲低也顯著抵消了METTL14耗竭依賴對胰腺癌細胞侵襲能力的抑制（圖6c）。此外，我們構建了編碼PERP-WT或PERP的質粒，其具有特定的3’-UTR位點突變，并評估了它們（轉染后）對過表達METTL14的胰腺癌細胞的致瘤特性的影響。我們觀察到METTL14的過表達降低了PERP的表達水平，增加了胰腺癌細胞的集落形成和侵襲能力（圖。6d-f）。然而，METTL14的過表達并不會影響過表達PERP并伴有3’-UTR突變的癌細胞（圖。6d-f）。這些發(fā)現提示PERP是METTL14促進胰腺癌生長的主要效應因子。

結論：我們的研究揭示了胰腺癌中m6A甲基化水平的升高是由m6A調節(jié)劑METTL14的失調引起的。我們還通過PERP mRNA的靶向性研究了METL14在胰腺癌生長和轉移中的重要作用。目前的研究不僅為胰腺癌發(fā)病機制的分子機制提供了新的見解，而且為開發(fā)針對m6A調節(jié)因子的胰腺癌更有效的治療策略鋪平了道路。