腸道微生物群影響嘌呤代謝，緩解結(jié)腸炎

   導(dǎo)讀：腸道微生物群在炎癥性腸病(IBD)中扮演重要角色，可能有益于潰瘍性結(jié)腸炎或克羅恩病的治療。靶向腸道菌群可能是治療IBD的一種新策略。大黃酸是大黃的主要成分之一，對(duì)某些疾病具有抗炎作用。江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室吳家偉等人在Theranostics（IF=8.579）上發(fā)表文章，探討了大黃酸對(duì)結(jié)腸炎的影響并探討其可能的機(jī)制。

   技術(shù)路線圖：
  

研究結(jié)果：

1.大黃酸能緩解DSS誘導(dǎo)的小鼠慢性結(jié)腸炎

我們?cè)u(píng)估大黃酸是否能在小鼠慢性結(jié)腸炎模型中發(fā)揮抗炎作用(圖1A)。大黃酸100 mg/kg可減輕結(jié)腸縮短，而50 mg/kg和100 mg/kg大黃酸處理組的免疫細(xì)胞浸潤和組織損傷均小于DSS組(圖1C-F)。慢性DSS導(dǎo)致體重下降，但在大黃酸治療后體重略有增加(圖1B)。50 mg/kg和100 mg/kg 大黃酸處理均可逆轉(zhuǎn)DSS引起LCN2 (小鼠腸道炎癥敏感標(biāo)志物)明顯升高(Figure 1G)。

結(jié)腸炎也會(huì)導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子或趨化因子的增加。慢性DSS導(dǎo)致小鼠血清中IL-17A和CXCL1顯著增加(圖2A-D)；文章檢測(cè)了小鼠腸系膜淋巴結(jié)(MLN)中的Th17細(xì)胞（與結(jié)腸炎癥密切相關(guān)）。與血清中結(jié)果相似，100 mg/kg大黃酸處理的小鼠MLN中Th17細(xì)胞減少，而50 mg/kg 大黃酸處理沒有影響(圖2E)。Th1/Th2細(xì)胞失衡也是結(jié)腸炎的一個(gè)重要特征。如圖2F-G所示，在結(jié)腸炎期間，Th1細(xì)胞顯著增多，而DSS組Th2細(xì)胞減少。大黃酸處理只降低Th1細(xì)胞。大黃酸處理對(duì)正常組沒有任何明顯的副作用或促炎反應(yīng)(結(jié)果未顯示)。這些數(shù)據(jù)表明大黃酸治療可以改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎，并且100 mg/kg大黃酸處理比50 mg/kg更有效。

Figure1

Figure2

2. 大黃酸改變嘌呤代謝，降低尿酸水平

代謝變化被認(rèn)為是腸病最重要的特征之一，炎癥改變腸道代謝狀況。文章使用非靶向代謝組學(xué)來識(shí)別在小鼠腸道中可能發(fā)生改變的關(guān)鍵代謝物和代謝途徑。糞便中共鑒定出159種代謝物，PCA分析發(fā)現(xiàn)DSS組與100 mg/kg 大黃酸組之間存在差異(圖3A)。并鑒定出兩組間有23種差異表達(dá)的代謝物，通路富集分析發(fā)現(xiàn)嘌呤代謝改變比較明顯(圖3B)。嘌呤在細(xì)胞中執(zhí)行許多重要的功能，如核酸、DNA和核酸單體前體的形成，RNA是最相關(guān)的一個(gè)(圖3C)。參與嘌呤代謝的酶的平衡被破壞，就會(huì)導(dǎo)致過量尿酸的產(chǎn)生，尿酸是嘌呤代謝的最終代謝物。文章分析發(fā)現(xiàn)DSS導(dǎo)致尿酸濃度顯著升高，而大黃酸降低了尿酸濃度（圖3D）。綜上所述，結(jié)果說明結(jié)腸炎期間嘌呤代謝途徑的改變，大黃酸導(dǎo)致嘌呤代謝正?；湍c道尿酸水平的降低。

3.尿酸升高直接引起腸道屏障損傷

血清或尿液中尿酸濃度的升高與痛風(fēng)、腎臟和血管疾病密切相關(guān)。文章檢測(cè)尿酸對(duì)腸道屏障完整性的影響。尿酸處理7天沒有觀察到明顯的炎癥，少數(shù)免疫細(xì)胞浸潤(圖4A)。然而，腸道通透性增加(圖4B)。緊密連接蛋白claudin-1和細(xì)胞粘附蛋白E-cadherin表達(dá)降低，如圖4C所示。結(jié)腸黏液層是形成腸道屏障的關(guān)鍵成分，維持腸道穩(wěn)態(tài)。文章觀察到杯狀細(xì)胞黏液層變薄，黏液素-2分泌減少(圖4D)。大黃酸恢復(fù)了claudin-1、E-cadherin的表達(dá)和粘液分泌。人正常結(jié)腸細(xì)胞NC -460進(jìn)一步驗(yàn)證。與體內(nèi)的研究結(jié)果一致，尿酸治療降低了claudin-1和E-cadherin的表達(dá)(圖4E)。尿酸+100mg /kg大黃酸對(duì)DSS誘導(dǎo)的慢性結(jié)腸炎也有較強(qiáng)的保護(hù)作用(結(jié)果未顯示)，說明尿酸不影響大黃酸的保護(hù)作用。這些數(shù)據(jù)表明，大黃酸治療可以消除尿酸引起的腸道通透性增強(qiáng)

Figure 4

4. 大黃酸處理改變腸道菌群組成，增加乳酸桿菌水平導(dǎo)致尿酸水平下降

雖然大黃酸治療沒有直接降低尿酸濃度，但它導(dǎo)致體內(nèi)尿酸水平降低，文章推測(cè)細(xì)菌可能是導(dǎo)致小鼠腸道尿酸降低的主要原因。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們利用16s核糖體RNA基因測(cè)序來確定大黃酸治療是否會(huì)改變腸道菌群組成。PCA分析顯示，每組微生物群組成的聚類不同(圖5A-B)。與DSS組相比，100 mg/kg 大黃酸處理組中不同細(xì)菌屬的乳酸菌表達(dá)增加(圖5C)。STAMP分析和定量PCR進(jìn)一步證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)(圖5D-F)。結(jié)果表明，大黃酸處理后的乳酸菌數(shù)量顯著增加。因此，糞便中的乳酸濃度增加(圖5E)。

乳酸菌是益生菌，在嘌呤代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用(圖6A)。在體外培養(yǎng)乳酸菌，并將上清與NCM-460細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)乳酸菌上清液降低了尿酸濃度，說明乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物降低尿酸的作用(圖6B)。大黃酸處理沒有改變?nèi)樗峋蛩岬漠a(chǎn)生，提示尿酸水平的變化可能源于腸上皮細(xì)胞(圖6C)。文章中進(jìn)行糞便微生物群移植(FMT)發(fā)現(xiàn)DSS或100 mg/kg大黃素處理小鼠的糞便微生物被移植到DSS受體中(圖7A)。正如預(yù)期的那樣，F(xiàn)MT可降低DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中的尿酸(圖6D)。這些結(jié)果表明，大黃酸可以改變腸道菌群組成，增加乳酸菌豐度，降低腸上皮細(xì)胞尿酸的產(chǎn)生。

Figure 5

Figure 6

6. FMT改善了DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎，恢復(fù)腸屏障功能

文章使用FMT(糞微生態(tài)移植)來確定大黃酸改變的腸道菌群是否對(duì)結(jié)腸炎有療效。如圖7A-E所示，F(xiàn)MT可以顯著減輕結(jié)腸組織切片的血管收縮期結(jié)腸炎，降低免疫細(xì)胞浸潤。此外，F(xiàn)MT組E-cadherin和claudin-1表達(dá)增加，提示黏液層厚度恢復(fù)(圖7F-G)。FMT保護(hù)了腸道泄漏(圖7H-I)。與DSS組相比，F(xiàn)MT組乳酸菌水平也出現(xiàn)了上調(diào)(結(jié)果未顯示)。這些數(shù)據(jù)表明FMT改善了DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎并阻止了腸道屏障的通透性;研究顯示DSS治療期間大黃酸改變的微生物群對(duì)結(jié)腸炎有益。

Figure 7