VDR–SOX2信號(hào)與大腸癌進(jìn)展

酸性腫瘤微環(huán)境為惡性腫瘤的發(fā)展提供了能量來源。細(xì)胞對酸性環(huán)境的適應(yīng)導(dǎo)致了癌癥干細(xì)胞的出現(xiàn)。維生素D受體（VDR）的表達(dá)與大腸癌（CRC）的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但其在CRC干細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。今天給大家?guī)淼陌l(fā)表于“Signal Transduction and Targeted Therapy”，影響因子13.493的文章“VDR–SOX2 signaling promotes colorectal cancer stemness and malignancy in an acidic microenvironment”，詳細(xì)介紹了VDR–SOX2信號(hào)調(diào)控大腸癌發(fā)展的機(jī)制。

我們的研究表明，酸中毒通過下調(diào)PPARD的表達(dá)降低了VDR的表達(dá)。過表達(dá)VDR能有效抑制酸中毒細(xì)胞的干性和奧沙利鉑耐藥。VDR核輸出信號(hào)對酸中毒敏感，VDR從細(xì)胞核中輸出。此外，染色質(zhì)免疫沉淀和高通量測序分析顯示，VDR通過結(jié)合SOX2啟動(dòng)子中的維生素D反應(yīng)元件轉(zhuǎn)錄抑制SOX2，損害腫瘤生長和耐藥性。

技術(shù)路線

結(jié)果：

1）酸中毒抑制VDR表達(dá)，VDR表達(dá)與惡性大腸癌呈負(fù)相關(guān)

為了研究酸性腫瘤微環(huán)境對大腸癌細(xì)胞干細(xì)胞的影響，我們首先從大腸癌患者的組織樣本中分離并鑒定了RKO干細(xì)胞樣細(xì)胞和原代大腸癌細(xì)胞、大腸癌干細(xì)胞。將細(xì)胞培養(yǎng)在不同pH值的培養(yǎng)基中，以評(píng)估細(xì)胞自我更新的最佳條件。在pH值為6.8的酸性條件下，腫瘤球的數(shù)量最大化（圖1a、b）。與pH值7.4相比，pH值6.8顯著增加了CD133陽性細(xì)胞的百分率，促進(jìn)了CD133、OCT4和SOX2的表達(dá)（圖1c）。因此，酸性腫瘤微環(huán)境可以誘導(dǎo)和維持大腸癌細(xì)胞的CSC表型。

為了確定酸性微環(huán)境中CSC表型調(diào)控的重要途徑，我們對pH7.4和6.8培養(yǎng)的RKO細(xì)胞進(jìn)行RNA測序和信號(hào)通路富集分析。我們發(fā)現(xiàn)脂溶性維生素的代謝過程被酸性條件顯著改變（圖1d）。維生素D是一種重要的脂溶性維生素，已知維生素D信號(hào)通路參與癌細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)。因此，我們在pH值為7.4和6.8的條件下測試了維生素D信號(hào)通路中具有關(guān)鍵作用的幾種蛋白質(zhì)的表達(dá)（圖1e），發(fā)現(xiàn)各細(xì)胞系VDR表達(dá)在酸中毒時(shí)明顯下降（圖1f，g）。大腸癌組織與配對相鄰組織中VDR的mRNA表達(dá)差異顯著（圖1h）。此外，VDR在復(fù)發(fā)性大腸癌組織中的表達(dá)顯著降低（圖1i）。TCGA和Skrzypczak，Kaiser和Hong數(shù)據(jù)庫顯示，VDR在大腸癌組織中的表達(dá)低于正常組織（圖1j），VDR在Ⅳ期大腸癌組織中的表達(dá)最低（圖1k）。我們還研究了VDR表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果表明VDR表達(dá)低的患者生存時(shí)間短（圖1l）。LAMP2的表達(dá)與腫瘤微環(huán)境酸性呈正相關(guān)，并且我們發(fā)現(xiàn)VDR表達(dá)和LAMP2在大腸癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（圖1m）。提示酸性腫瘤微環(huán)境可抑制VDR的表達(dá)，而VDR的表達(dá)與大腸癌的惡性程度及復(fù)發(fā)密切相關(guān)。

2）VDR損害大腸癌的干細(xì)胞和惡性腫瘤

為了研究VDR對大腸癌干細(xì)胞表型的影響，我們首先證實(shí)了VDR在大腸癌干細(xì)胞中的表達(dá)低于非干細(xì)胞癌細(xì)胞（圖2a）。此外，在抗奧沙利鉑的HCT116細(xì)胞中VDR表達(dá)降低（圖2b）。因此，我們在低VDR表達(dá)的大腸癌干細(xì)胞中過表達(dá)VDR（圖2c）。顯微成像顯示腫瘤球粘附在板的底部，腫瘤球內(nèi)發(fā)生細(xì)胞分化（圖2d）。VDR過表達(dá)顯著減少了由CRC干細(xì)胞形成的腫瘤球的大小和數(shù)量（圖2d，e），并顯著降低CD133陽性細(xì)胞的百分比（圖2f）。這些結(jié)果表明VDR過表達(dá)抑制了大腸癌干細(xì)胞的自我更新和誘導(dǎo)細(xì)胞分化。此外，VDR的過表達(dá)增加了大腸癌干細(xì)胞對奧沙利鉑的敏感性，并部分減弱了酸性腫瘤微環(huán)境介導(dǎo)的耐藥促進(jìn)作用（圖2g）。接下來，我們觀察到VDR的敲除（圖2h）可以提高CRC細(xì)胞的自我更新能力（圖2i–k），促進(jìn)干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)（圖2l）。此外，VDR的敲除增加了CD133陽性細(xì)胞的百分比（圖2m），增強(qiáng)了對奧沙利鉑的抵抗力（圖2n）。這些結(jié)果表明，VDR在酸性腫瘤微環(huán)境中抑制CSC表型，提高大腸癌干細(xì)胞對藥物的敏感性。

3）VDR通過抑制SOX2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性來下調(diào)SOX2的表達(dá)

為了闡明VDR如何影響大腸癌的CSC表型和耐藥性，我們用染色質(zhì)免疫沉淀法（ChIP）分析了VDR對干細(xì)胞標(biāo)記物轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)VDR可與SOX2、OCT4、CD44和NANOG的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合（圖3a、b）。然后，我們利用高通量測序（ATAC-seq）信號(hào)分析了在酸性或堿性條件下培養(yǎng)的大腸癌細(xì)胞中干性基因的染色質(zhì)可及性。在酸性條件下，SOX2中的開放染色質(zhì)優(yōu)先出現(xiàn)在TSS的上游（圖3c），這可能反映了VDR在SOX2啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合的可能性。我們證實(shí)過表達(dá)VDR（圖3d）會(huì)降低SOX2蛋白的表達(dá)，并且在過表達(dá)VDR的細(xì)胞中結(jié)合作用增強(qiáng)（圖3e）。VDR的過表達(dá)抑制了SOX2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，而VDR的敲除促進(jìn)了它的轉(zhuǎn)錄活性（圖3f）。我們進(jìn)一步刪除了SOX2啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合序列（圖3g），發(fā)現(xiàn)VDR對SOX2啟動(dòng)子的抑制作用減弱（圖3h–j）。通過生物信息學(xué)分析，我們在SOX2啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)了三個(gè)VDREs（圖3g）。我們對SOX2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行了檢測和檢測。突變1和突變3顯著減弱了VDR的抑制作用（圖3k）。這些結(jié)果表明VDR可能通過抑制SOX2啟動(dòng)子活性來下調(diào)SOX2的表達(dá)。

4）酸性腫瘤微環(huán)境通過VDR-SOX2軸調(diào)控CRC的干細(xì)胞特性和耐藥

為了證實(shí)VDR通過下調(diào)SOX2的表達(dá)來抑制CRC細(xì)胞的惡性表型，我們在過表達(dá)VDR的CRC干細(xì)胞中過表達(dá)SOX2（圖4a）。大腸癌干細(xì)胞的自我更新能力隨著SOX2過表達(dá)而增強(qiáng)（圖4b）。在低VDR水平的CRC細(xì)胞中，SOX2的敲除降低了CD133和CD44的表達(dá)（圖4c）并降低了自我更新能力（圖4d）。我們還分析了酸性和堿性pH中有和沒有VDR表達(dá)的大腸癌干細(xì)胞中SOX2 mRNA。結(jié)果表明，在酸性pH條件下，在沒有VDR表達(dá)的細(xì)胞中SOX2 mRNA表達(dá)增加（圖4e）。與先前的結(jié)果一致，在酸性腫瘤微環(huán)境中敲除SOX2減弱了結(jié)直腸癌干細(xì)胞的自我更新能力（圖4f），并增強(qiáng)了細(xì)胞對奧沙利鉑的敏感性（圖4g）。在pH6.8時(shí)，我們檢測了SOX2沉默時(shí)干細(xì)胞基因網(wǎng)絡(luò)的mRNA表達(dá)。結(jié)果表明，當(dāng)沉默SOX2時(shí)，干細(xì)胞基因OCT4，MYC和CCND1下調(diào)（圖4h）。此外，我們發(fā)現(xiàn)維生素D的活性形式可以逆轉(zhuǎn)酸性環(huán)境介導(dǎo)的自我更新和CD133、SOX2和OCT4在大腸癌干細(xì)胞中的表達(dá)（圖4i，j），提示酸性微環(huán)境通過維生素D-VDR信號(hào)通路影響大腸癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性?？傊?，我們的研究結(jié)果表明，在酸性腫瘤微環(huán)境中VDR的下調(diào)減輕了SOX2的轉(zhuǎn)錄抑制，導(dǎo)致SOX2表達(dá)增加。這些變化促進(jìn)了大腸癌細(xì)胞的干性和耐藥性。

5）酸性微環(huán)境抑制核內(nèi)VDR聚集，通過PPARD抑制VDR表達(dá)

VDR調(diào)節(jié)細(xì)胞核中的靶基因。因此，我們檢測了VDR在酸性環(huán)境中的亞細(xì)胞定位。我們發(fā)現(xiàn)在酸性條件下，VDR的表達(dá)減少，VDR蛋白在細(xì)胞核中的積累減少（圖5a，b）。進(jìn)一步的分析表明，在酸性條件下VDR包含核輸出信號(hào)（NES）（圖5c）。LMB與CRM1結(jié)合，并抑制其他輸出底物的結(jié)合。我們在pH7.4和6.8下用LMB處理大腸癌細(xì)胞。LMB在pH6.8培養(yǎng)基中阻止了VDR蛋白的核輸出（圖5d），說明酸性環(huán)境下VDR蛋白的核輸出依賴于CRM1。為了證實(shí)VDR的核輸出需要NES，我們用野生型和NES位點(diǎn)突變質(zhì)粒（圖5c）轉(zhuǎn)染CRC細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)VDR的NES突變阻止了VDR在酸性環(huán)境下的核輸出（圖5e）。為了研究核VDR的表達(dá)是否使細(xì)胞對pH驅(qū)動(dòng)的重編程不敏感，我們用野生型和NES位點(diǎn)突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CC組織CSCs，并將其置于酸性條件下。結(jié)果表明，VDR的NES突變抑制了大腸癌干細(xì)胞在酸性條件下的自我更新（圖5f）。這一發(fā)現(xiàn)表明，VDR在酸性腫瘤微環(huán)境中的核輸出是由NES介導(dǎo)的，并且依賴于CRM1。

利用Qiagen數(shù)據(jù)庫，我們預(yù)測PPAR家族成員與VDR啟動(dòng)子密切相關(guān)。我們首先分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中CRC數(shù)據(jù)中PPARA、PPARD、PPARG和VDR之間的相關(guān)性（圖5g）。PPARA和PPARD表達(dá)與VDR表達(dá)呈正相關(guān)（圖5g）。我們還發(fā)現(xiàn)，在酸性條件下，大腸癌細(xì)胞中PPARD mRNA和蛋白質(zhì)水平顯著降低（圖5h，i），令人驚訝的是，PPARD可以與VDR的啟動(dòng)子結(jié)合（圖5j），PPARD的敲除降低了VDR的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，上調(diào)了干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)（圖5k–m）。這些結(jié)果表明，酸性腫瘤微環(huán)境通過PPARD抑制VDR的表達(dá)，誘導(dǎo)VDR蛋白的核輸出，抑制VDR的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。 

6）酸性腫瘤微環(huán)境的正?；蚔DR表達(dá)的誘導(dǎo)抑制了大腸癌的發(fā)生和發(fā)展

為了確定是否可以通過改變酸性腫瘤微環(huán)境和VDR表達(dá)來抑制大腸癌的生長，我們將大腸癌細(xì)胞注射到裸鼠體內(nèi)，并給予小鼠水或碳酸氫鈉（NaHCO3）溶液。我們發(fā)現(xiàn)，VDR過表達(dá)后的NaHCO3處理顯著抑制了SOX2的表達(dá)和腫瘤的發(fā)展（圖6a），并且NaHCO3處理還有效地減弱了VDR敲除后的SOX2表達(dá)和腫瘤形成（圖6b）。這些結(jié)果表明，降低腫瘤微環(huán)境的酸性和誘導(dǎo)VDR的表達(dá)可以抑制大腸癌的發(fā)展。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，維生素D信號(hào)激活和奧沙利鉑聯(lián)合治療可以抑制患者來源的異種移植物的腫瘤生長（圖6c）。PDXs中VDR表達(dá)上調(diào)，SOX2表達(dá)下調(diào)（圖6d）。這些結(jié)果為大腸癌的臨床治療提供了新的理論依據(jù)。

7）VDR表達(dá)與SOX2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，有可能用于臨床預(yù)后預(yù)測

我們在體內(nèi)驗(yàn)證了VDR和SOX2表達(dá)對大腸癌干細(xì)胞致瘤能力的影響。體內(nèi)極限稀釋實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，VDR的過表達(dá)顯著抑制腫瘤的發(fā)生，而SOX2的過表達(dá)則減弱了VDR過表達(dá)的抑制作用（圖6e）。VDR和SOX2高/低表達(dá)患者的總生存率（OS）有顯著差異。VDR低表達(dá)和SOX2高表達(dá)的患者預(yù)后最差（圖7a，b）。VDR和SOX2在III期和IV期標(biāo)本中的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（圖7c）。此外，我們評(píng)估了65例接受FOLFOX或XELOX方案治療的晚期大腸癌患者樣本中VDR和SOX2的表達(dá)。原發(fā)性腫瘤中VDR高表達(dá)的患者中僅有27.69%對化療有耐藥性，而SOX2高表達(dá)的患者對化療耐藥率為72.31%。VDR低表達(dá)和SOX2高表達(dá)組化療耐藥比例最高（圖7d）。這些結(jié)果表明，低VDR表達(dá)和高SOX2表達(dá)都預(yù)示著奧沙利鉑化療的耐藥性。

結(jié)論：這些發(fā)現(xiàn)揭示了酸性腫瘤微環(huán)境通過調(diào)節(jié)SOX2的表達(dá)而影響大腸癌細(xì)胞CSC表型的新機(jī)制，并表明VDR表達(dá)異常導(dǎo)致維生素D信號(hào)的無效激活，導(dǎo)致維生素D在抗腫瘤過程中缺乏作用。