VDR–SOX2信號與大腸癌進展

酸性腫瘤微環(huán)境為惡性腫瘤的發(fā)展提供了能量來源。細胞對酸性環(huán)境的適應導致了癌癥干細胞的出現(xiàn)。維生素D受體（VDR）的表達與大腸癌（CRC）的發(fā)生發(fā)展密切相關，但其在CRC干細胞中的調控機制尚不清楚。今天給大家?guī)淼陌l(fā)表于“Signal Transduction and Targeted Therapy”，影響因子13.493的文章“VDR–SOX2 signaling promotes colorectal cancer stemness and malignancy in an acidic microenvironment”，詳細介紹了VDR–SOX2信號調控大腸癌發(fā)展的機制。

我們的研究表明，酸中毒通過下調PPARD的表達降低了VDR的表達。過表達VDR能有效抑制酸中毒細胞的干性和奧沙利鉑耐藥。VDR核輸出信號對酸中毒敏感，VDR從細胞核中輸出。此外，染色質免疫沉淀和高通量測序分析顯示，VDR通過結合SOX2啟動子中的維生素D反應元件轉錄抑制SOX2，損害腫瘤生長和耐藥性。

技術路線

結果：

1）酸中毒抑制VDR表達，VDR表達與惡性大腸癌呈負相關

為了研究酸性腫瘤微環(huán)境對大腸癌細胞干細胞的影響，我們首先從大腸癌患者的組織樣本中分離并鑒定了RKO干細胞樣細胞和原代大腸癌細胞、大腸癌干細胞。將細胞培養(yǎng)在不同pH值的培養(yǎng)基中，以評估細胞自我更新的最佳條件。在pH值為6.8的酸性條件下，腫瘤球的數量最大化（圖1a、b）。與pH值7.4相比，pH值6.8顯著增加了CD133陽性細胞的百分率，促進了CD133、OCT4和SOX2的表達（圖1c）。因此，酸性腫瘤微環(huán)境可以誘導和維持大腸癌細胞的CSC表型。

為了確定酸性微環(huán)境中CSC表型調控的重要途徑，我們對pH7.4和6.8培養(yǎng)的RKO細胞進行RNA測序和信號通路富集分析。我們發(fā)現(xiàn)脂溶性維生素的代謝過程被酸性條件顯著改變（圖1d）。維生素D是一種重要的脂溶性維生素，已知維生素D信號通路參與癌細胞分化的調節(jié)。因此，我們在pH值為7.4和6.8的條件下測試了維生素D信號通路中具有關鍵作用的幾種蛋白質的表達（圖1e），發(fā)現(xiàn)各細胞系VDR表達在酸中毒時明顯下降（圖1f，g）。大腸癌組織與配對相鄰組織中VDR的mRNA表達差異顯著（圖1h）。此外，VDR在復發(fā)性大腸癌組織中的表達顯著降低（圖1i）。TCGA和Skrzypczak，Kaiser和Hong數據庫顯示，VDR在大腸癌組織中的表達低于正常組織（圖1j），VDR在Ⅳ期大腸癌組織中的表達最低（圖1k）。我們還研究了VDR表達與預后的關系，結果表明VDR表達低的患者生存時間短（圖1l）。LAMP2的表達與腫瘤微環(huán)境酸性呈正相關，并且我們發(fā)現(xiàn)VDR表達和LAMP2在大腸癌中的表達呈負相關（圖1m）。提示酸性腫瘤微環(huán)境可抑制VDR的表達，而VDR的表達與大腸癌的惡性程度及復發(fā)密切相關。

2）VDR損害大腸癌的干細胞和惡性腫瘤

為了研究VDR對大腸癌干細胞表型的影響，我們首先證實了VDR在大腸癌干細胞中的表達低于非干細胞癌細胞（圖2a）。此外，在抗奧沙利鉑的HCT116細胞中VDR表達降低（圖2b）。因此，我們在低VDR表達的大腸癌干細胞中過表達VDR（圖2c）。顯微成像顯示腫瘤球粘附在板的底部，腫瘤球內發(fā)生細胞分化（圖2d）。VDR過表達顯著減少了由CRC干細胞形成的腫瘤球的大小和數量（圖2d，e），并顯著降低CD133陽性細胞的百分比（圖2f）。這些結果表明VDR過表達抑制了大腸癌干細胞的自我更新和誘導細胞分化。此外，VDR的過表達增加了大腸癌干細胞對奧沙利鉑的敏感性，并部分減弱了酸性腫瘤微環(huán)境介導的耐藥促進作用（圖2g）。接下來，我們觀察到VDR的敲除（圖2h）可以提高CRC細胞的自我更新能力（圖2i–k），促進干細胞標記物的表達（圖2l）。此外，VDR的敲除增加了CD133陽性細胞的百分比（圖2m），增強了對奧沙利鉑的抵抗力（圖2n）。這些結果表明，VDR在酸性腫瘤微環(huán)境中抑制CSC表型，提高大腸癌干細胞對藥物的敏感性。

3）VDR通過抑制SOX2啟動子的轉錄活性來下調SOX2的表達

為了闡明VDR如何影響大腸癌的CSC表型和耐藥性，我們用染色質免疫沉淀法（ChIP）分析了VDR對干細胞標記物轉錄的調節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)VDR可與SOX2、OCT4、CD44和NANOG的啟動子區(qū)結合（圖3a、b）。然后，我們利用高通量測序（ATAC-seq）信號分析了在酸性或堿性條件下培養(yǎng)的大腸癌細胞中干性基因的染色質可及性。在酸性條件下，SOX2中的開放染色質優(yōu)先出現(xiàn)在TSS的上游（圖3c），這可能反映了VDR在SOX2啟動子區(qū)域結合的可能性。我們證實過表達VDR（圖3d）會降低SOX2蛋白的表達，并且在過表達VDR的細胞中結合作用增強（圖3e）。VDR的過表達抑制了SOX2啟動子的轉錄活性，而VDR的敲除促進了它的轉錄活性（圖3f）。我們進一步刪除了SOX2啟動子區(qū)域的結合序列（圖3g），發(fā)現(xiàn)VDR對SOX2啟動子的抑制作用減弱（圖3h–j）。通過生物信息學分析，我們在SOX2啟動子中發(fā)現(xiàn)了三個VDREs（圖3g）。我們對SOX2啟動子的轉錄活性進行了檢測和檢測。突變1和突變3顯著減弱了VDR的抑制作用（圖3k）。這些結果表明VDR可能通過抑制SOX2啟動子活性來下調SOX2的表達。

4）酸性腫瘤微環(huán)境通過VDR-SOX2軸調控CRC的干細胞特性和耐藥

為了證實VDR通過下調SOX2的表達來抑制CRC細胞的惡性表型，我們在過表達VDR的CRC干細胞中過表達SOX2（圖4a）。大腸癌干細胞的自我更新能力隨著SOX2過表達而增強（圖4b）。在低VDR水平的CRC細胞中，SOX2的敲除降低了CD133和CD44的表達（圖4c）并降低了自我更新能力（圖4d）。我們還分析了酸性和堿性pH中有和沒有VDR表達的大腸癌干細胞中SOX2 mRNA。結果表明，在酸性pH條件下，在沒有VDR表達的細胞中SOX2 mRNA表達增加（圖4e）。與先前的結果一致，在酸性腫瘤微環(huán)境中敲除SOX2減弱了結直腸癌干細胞的自我更新能力（圖4f），并增強了細胞對奧沙利鉑的敏感性（圖4g）。在pH6.8時，我們檢測了SOX2沉默時干細胞基因網絡的mRNA表達。結果表明，當沉默SOX2時，干細胞基因OCT4，MYC和CCND1下調（圖4h）。此外，我們發(fā)現(xiàn)維生素D的活性形式可以逆轉酸性環(huán)境介導的自我更新和CD133、SOX2和OCT4在大腸癌干細胞中的表達（圖4i，j），提示酸性微環(huán)境通過維生素D-VDR信號通路影響大腸癌細胞的干細胞特性?？傊?，我們的研究結果表明，在酸性腫瘤微環(huán)境中VDR的下調減輕了SOX2的轉錄抑制，導致SOX2表達增加。這些變化促進了大腸癌細胞的干性和耐藥性。

5）酸性微環(huán)境抑制核內VDR聚集，通過PPARD抑制VDR表達

VDR調節(jié)細胞核中的靶基因。因此，我們檢測了VDR在酸性環(huán)境中的亞細胞定位。我們發(fā)現(xiàn)在酸性條件下，VDR的表達減少，VDR蛋白在細胞核中的積累減少（圖5a，b）。進一步的分析表明，在酸性條件下VDR包含核輸出信號（NES）（圖5c）。LMB與CRM1結合，并抑制其他輸出底物的結合。我們在pH7.4和6.8下用LMB處理大腸癌細胞。LMB在pH6.8培養(yǎng)基中阻止了VDR蛋白的核輸出（圖5d），說明酸性環(huán)境下VDR蛋白的核輸出依賴于CRM1。為了證實VDR的核輸出需要NES，我們用野生型和NES位點突變質粒（圖5c）轉染CRC細胞，發(fā)現(xiàn)VDR的NES突變阻止了VDR在酸性環(huán)境下的核輸出（圖5e）。為了研究核VDR的表達是否使細胞對pH驅動的重編程不敏感，我們用野生型和NES位點突變質粒轉染CC組織CSCs，并將其置于酸性條件下。結果表明，VDR的NES突變抑制了大腸癌干細胞在酸性條件下的自我更新（圖5f）。這一發(fā)現(xiàn)表明，VDR在酸性腫瘤微環(huán)境中的核輸出是由NES介導的，并且依賴于CRM1。

利用Qiagen數據庫，我們預測PPAR家族成員與VDR啟動子密切相關。我們首先分析了TCGA數據庫中CRC數據中PPARA、PPARD、PPARG和VDR之間的相關性（圖5g）。PPARA和PPARD表達與VDR表達呈正相關（圖5g）。我們還發(fā)現(xiàn)，在酸性條件下，大腸癌細胞中PPARD mRNA和蛋白質水平顯著降低（圖5h，i），令人驚訝的是，PPARD可以與VDR的啟動子結合（圖5j），PPARD的敲除降低了VDR的mRNA和蛋白質表達，上調了干細胞標記物的表達（圖5k–m）。這些結果表明，酸性腫瘤微環(huán)境通過PPARD抑制VDR的表達，誘導VDR蛋白的核輸出，抑制VDR的轉錄調控功能。 

6）酸性腫瘤微環(huán)境的正常化和VDR表達的誘導抑制了大腸癌的發(fā)生和發(fā)展

為了確定是否可以通過改變酸性腫瘤微環(huán)境和VDR表達來抑制大腸癌的生長，我們將大腸癌細胞注射到裸鼠體內，并給予小鼠水或碳酸氫鈉（NaHCO3）溶液。我們發(fā)現(xiàn)，VDR過表達后的NaHCO3處理顯著抑制了SOX2的表達和腫瘤的發(fā)展（圖6a），并且NaHCO3處理還有效地減弱了VDR敲除后的SOX2表達和腫瘤形成（圖6b）。這些結果表明，降低腫瘤微環(huán)境的酸性和誘導VDR的表達可以抑制大腸癌的發(fā)展。我們進一步發(fā)現(xiàn)，維生素D信號激活和奧沙利鉑聯(lián)合治療可以抑制患者來源的異種移植物的腫瘤生長（圖6c）。PDXs中VDR表達上調，SOX2表達下調（圖6d）。這些結果為大腸癌的臨床治療提供了新的理論依據。

7）VDR表達與SOX2表達呈負相關，有可能用于臨床預后預測

我們在體內驗證了VDR和SOX2表達對大腸癌干細胞致瘤能力的影響。體內極限稀釋實驗的結果顯示，VDR的過表達顯著抑制腫瘤的發(fā)生，而SOX2的過表達則減弱了VDR過表達的抑制作用（圖6e）。VDR和SOX2高/低表達患者的總生存率（OS）有顯著差異。VDR低表達和SOX2高表達的患者預后最差（圖7a，b）。VDR和SOX2在III期和IV期標本中的表達水平呈負相關（圖7c）。此外，我們評估了65例接受FOLFOX或XELOX方案治療的晚期大腸癌患者樣本中VDR和SOX2的表達。原發(fā)性腫瘤中VDR高表達的患者中僅有27.69%對化療有耐藥性，而SOX2高表達的患者對化療耐藥率為72.31%。VDR低表達和SOX2高表達組化療耐藥比例最高（圖7d）。這些結果表明，低VDR表達和高SOX2表達都預示著奧沙利鉑化療的耐藥性。

結論：這些發(fā)現(xiàn)揭示了酸性腫瘤微環(huán)境通過調節(jié)SOX2的表達而影響大腸癌細胞CSC表型的新機制，并表明VDR表達異常導致維生素D信號的無效激活，導致維生素D在抗腫瘤過程中缺乏作用。