上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化影響頭頸癌中鐵死亡
研究背景：鐵死亡是一種鐵依賴的脂質(zhì)過氧化引發(fā)的新型細胞死亡方式。鐵死亡是一種抑制抵抗癌癥治療的治療方法，具有上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)特性。EMT是上皮細胞打破細胞間和細胞間基質(zhì)黏附狀態(tài)的重要過程，賦予癌細胞化療耐藥性。因此，Jaewang Lee等人研究了EMT表觀遺傳重編程在促進頭頸癌(HNC)細胞的鐵死亡中的治療潛力。（Redox Biology IF= 9.986）
技術(shù)路線圖：
研究結(jié)果：
1.細胞密度和EMT標記物與鐵死亡敏感性相關(guān)
首先在胱氨酸耗竭培養(yǎng)條件下進行細胞死亡試驗，確定細胞密度是否會影響鐵死亡的敏感。在HN4癌細胞中，PI陽性細胞占比與每孔細胞數(shù)負相關(guān)(圖1A和B)。細胞脂質(zhì)過氧化水平也隨著HN4的增加而降低(圖1 C)。結(jié)果表明，細胞密度與鐵死亡敏感性有關(guān)。檢測了6個HNC細胞系的細胞死亡證實，癌細胞密度越大，存活時間越長 (圖1D)。E-cadherin上皮標志物在HN3、HN4、HN7和HN10中高表達，而間質(zhì)標志物vimentin和ZEB1在HN6和HN9中高表達(圖1E)。結(jié)果表明，EMT標記物的表達水平與鐵死亡的敏感性相關(guān)(圖1D和E)。在具有間質(zhì)性特征的HN6和HN9細胞中，鐵溶性誘導物RSL3暴露導致的細胞死亡顯著高于其他具有上皮性特征的HNC細胞系 (圖1F和G)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明向間充質(zhì)性質(zhì)的轉(zhuǎn)變可能使癌細胞更容易受到鐵胞作用的影響。
Figure1
2. E-cadherin調(diào)節(jié)鐵死亡的誘導
轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)處理HN3和HN4細胞，誘導EMT。沉默CDH1誘導了ZEB1和vimentin的表達(圖2A)。RSL3或磺胺嘧啶處理時，沉默CDH1使細胞更容易受到鐵死亡誘導劑的誘導。CDH1沉默增強了細胞死亡的增加，這與暴露于RSL3或磺胺嘧啶的癌細胞中不穩(wěn)定鐵水平的增加是同時發(fā)生的(圖2D)。CDH1過表達降低了ZEB1和vimentin在HN6細胞中的表達(圖2G)。RSL3、磺胺嘧啶或胱氨酸耗竭處理HN6細胞時，4-HNE和PTGS2表達增加，但在過表達CDH1的細胞中，增加的表達減少(圖2H)。過表達CDH1組細胞死亡降低 (圖2I)；細胞內(nèi)不穩(wěn)定鐵，脂質(zhì)過氧化,ROS生成的增加明顯降低(圖2 J K L); NAD/NADH比值下降 (圖2N);而GSH水平升高(圖2M)。這表明，在HN6和HN9中過表達CDH1可能增強具有間充質(zhì)特性的癌細胞的抗氧化系統(tǒng)。采用小鼠模型移植顯示，CDH1過表達時，腫瘤體積的減少程度低于經(jīng)磺胺嘧啶治療后的載體對照(圖2O)?；前粪奏ぬ幚砗驡SH含量降低，但NAD/NADH比值增加(圖2P Q)。綜上所述，結(jié)果表明控制E-cadherin在癌細胞中的表達可以調(diào)節(jié)鐵死亡的易感性。
Figure 2
3. ZEB1的表達改變了癌細胞對鐵死亡的敏感性
在HN6和HN9細胞中,沉默ZEB1誘導E-cadherin表達，抑制vimentin表達(圖3A)。暴露于RSL3或磺胺嘧啶后，細胞活力減少 (圖3B)。當使用RSL3、磺胺嘧啶或胱氨酸耗竭時，ZEB1沉默的癌細胞中LIP、脂質(zhì)過氧化和ROS的增加也低于對照組 (圖3C-E)。ZEB1在HN3和HN4細胞中過表達，誘導vimentin表達并抑制E-cadherin(圖3F)。RSL3、磺胺嘧啶或胱氨酸耗竭處理HN4細胞時，4-HNE和PTGS2表達增加，但在過表達ZEB1的細胞中，表達增加顯著(圖3G)。過表達ZEB1，RSL3或磺胺嘧啶處理的pi陽性細胞明顯增多，細胞存活率明顯下降 (圖3H、圖I)。LIP、脂質(zhì)ROS和胞漿內(nèi)ROS的數(shù)量，NAD/NADH比值顯著增加 (圖3J L N)。GSH水平降低(圖3M)。體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，過表達ZEB1組的腫瘤體積更小(圖3O)。過表達ZEB1組，磺胺嘧啶處理后GSH含量下降，NAD/NADH比值升高(圖3P和Q)。綜上所述，結(jié)果表明，腫瘤細胞中ZEB1的調(diào)控能夠調(diào)節(jié)鐵死亡的易感性。
Figure 3
4. SIRT1的激活促進HNC細胞的鐵死亡
探討針對ZEB1的EMT的表觀遺傳重編程是否能夠調(diào)節(jié)鐵死亡。SIRT1通過激活ZEB1的功能調(diào)節(jié)EMT。在HN6和HN9癌細胞中， SIRT1沉默或Ex-527(SIRT1特異性抑制劑)處理降低了ZEB1和vimentin的表達，但增加了E-cadherin的表達(圖4A)。與暴露于RSL3或磺胺嘧啶的對照組相比，SIRT1沉默或Ex-527治療后的癌細胞細胞存活率顯著提高，細胞死亡減少 (圖4B、C)。此外，不穩(wěn)定鐵、脂質(zhì)ROS和胞漿內(nèi)ROS的增加比對照組細胞少(圖4D F)。然而，SIRT1誘導劑白藜蘆醇顯著降低RSL3或磺胺嘧啶處理的HN3和HN4的存活率(圖4 G)。在HN3和HN4中，RSL3或磺胺嘧啶與SIRT1特異性誘導劑SRT1720的組合比增加組合基質(zhì)的對照更顯著地降低了細胞存活率，特別是在高濃度組合下(圖4H和I)。SIRT1720或白藜蘆醇處理增加了ZEB1和vimentin的表達，但降低了E-cadherin的表達(圖4J)。綜上所述，這一結(jié)果表明，SIRT1在HNC癌細胞中的控制可能通過抗氧化能力減弱而影響鐵死亡的誘導作用。
Figure 4
miR-200家族通過抑制ZEB1抑制EMT。首先轉(zhuǎn)染miR-200家族抑制劑(圖5A)，然后在HNC細胞中檢測RSL3、磺胺拉嗪或胱氨酸耗竭后細胞存活率、LIP和ROS的生成。MiR-200家族抑制劑增加了ZEB1和vimentin的表達，但降低了E-cadherin的表達(圖5B)。mir -200a抑制細胞中，HN3和HN4的細胞活力顯著下降，而pi陽性細胞比例的增加多于對照組(圖5 C和D)。與對照組相比，使用miR-200a inhibitor的細胞內(nèi)不穩(wěn)定鐵、脂質(zhì)過氧化和細胞內(nèi)ROS水平顯著升高(圖5 E G)。結(jié)果表明, miR-200家族抑制劑在癌細胞中誘導的EMT可能增強了對鐵死亡的敏感性。
Figure 5
6. 5-Azacitidine轉(zhuǎn)變?yōu)樯掀ば再|(zhì)，減弱鐵死亡敏感性
EMT受表觀遺傳學調(diào)控，文章中確認了EMT相關(guān)基因的甲基化水平?；虻募谆脚c蛋白質(zhì)的表達相反，如圖1E所示。CDH1的甲基化水平在間質(zhì)性的HN6和HN9中較高，而ZEB1、VIM和SIRT1的甲基化水平在上皮性的HN3和HN4中較高(圖6A)。5-Azacitidine是一種去甲基化劑，已知可以預防EMT。5-Azacitidine用RSL3或柳氮磺吡啶處理HN4和HN6。5-azacitidine治療誘導HN6細胞中CDH1甲基化水平降低和ZEB1，波形蛋白表達增加 (圖6 B和C)。這也導致了RSL3或磺胺嘧啶治療后的鐵死亡減少(圖6 D F)。在HN6細胞中，RSL3, 柳氮磺胺吡啶和胱氨酸耗竭引起的不穩(wěn)定鐵, 脂質(zhì)過氧化, 胞質(zhì)ROS的增加被5-Azacitidine減弱(圖6G I)。然而,細胞死亡和存活率、不穩(wěn)定鐵和脂質(zhì)過氧化水平在HN4之間無顯著差異。表明5-Azacitidine可能通過去甲基化上皮標志物CDH1來降低鐵亡誘導劑的敏感性。
Figure 6
