miR-142-5p誘導(dǎo)IDO促進(jìn)免疫抑制

  對(duì)免疫療法的臨床反應(yīng)與免疫抑制腫瘤微環(huán)境（TME）密切相關(guān)，并受腫瘤細(xì)胞與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（LEC）之間動(dòng)態(tài)相互作用的影響。本文發(fā)現(xiàn)晚期宮頸鱗狀細(xì)胞癌（CSCC）分泌的外泌體（LV）傳遞miR-142-5p通過(guò)誘導(dǎo)吲哚胺2,3-加雙氧酶（IDO）作用于CSCC的免疫TME，促進(jìn)疾病進(jìn)展。本文于2020年9月發(fā)表于《Cell Death & Differentiation》IF：10.717。

 本文技術(shù)路線如下：

本文主要結(jié)果：

1、在CSCC進(jìn)展過(guò)程中，miR-142-5p表達(dá)與淋巴細(xì)胞IDO表達(dá)相關(guān)，并與浸潤(rùn)的CD8+ T細(xì)胞數(shù)量負(fù)相關(guān)。

為了評(píng)估CSCC進(jìn)展過(guò)程中miR-142-5p表達(dá)，作者使用ISH分析了116個(gè)病人的組織微陣列，與早期組織相比，miR-142-5p的表達(dá)和癌周的IDO陽(yáng)性LV的比例都在晚期組織中顯著上調(diào)，但是CD8+ T細(xì)胞數(shù)量在CRCC進(jìn)展中減少了。因此，miR-142-5p的表達(dá)與癌周的IDO陽(yáng)性LV的和總的LV數(shù)量呈現(xiàn)正相關(guān)性，和浸潤(rùn)的CD8+ T細(xì)胞數(shù)量負(fù)相關(guān)。此外，淋巴管的miR-142-5p與IDO表達(dá)在腫瘤中的共定位與腫瘤中miR-142-5p高表達(dá)有關(guān)，表明腫瘤來(lái)源的miR-142-5p轉(zhuǎn)運(yùn)至癌周LV中可能上調(diào)了淋巴管IDO的表達(dá)。

圖1在CSCC進(jìn)展過(guò)程中，miR-142-5p表達(dá)與淋巴細(xì)胞IDO表達(dá)相關(guān)，并與浸潤(rùn)的CD8+ T細(xì)胞數(shù)量負(fù)相關(guān)。

 2、miR-142-5p可能通過(guò)CSCC分泌的外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)至人真皮淋巴內(nèi)皮細(xì)胞(HDLECs)

作者接下來(lái)探究了miR-142-5p是否通過(guò)外泌體途徑參與了CSCC細(xì)胞與HDLEC細(xì)胞間的串?dāng)_。如圖2A-C所示，是提取的CSCC分泌的外泌體，具有典型的外泌體特征，隨后與HDLEC共孵育，結(jié)果顯示，綠色熒標(biāo)記的外泌體均可被其吸收內(nèi)化，但是與對(duì)照組外泌體相比，miR-142-5p外泌體組孵育后的HDLEC細(xì)胞中miR-142-5p的表達(dá)顯著更高。

圖2 miR-142-5p可以通過(guò)CSCC分泌的外泌體轉(zhuǎn)移到HDLECs

 3、CSCC分泌的外泌體miR-142-5p上調(diào)淋巴管IDO的表達(dá)

進(jìn)一步分析外泌體miR-142-5p介導(dǎo)的淋巴管IDO表達(dá)的生物學(xué)功能，分析了HDLEC細(xì)胞與CSCC外泌體孵育48小時(shí)后的IDO的表達(dá)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)miR-142-5p mimics處理的或者外泌體miR-142-5p處理的HDLEC細(xì)胞中IDO的表達(dá)顯著升高(Fig. 3a)。由于IDO酶降解色氨酸并生成色氨酸分解代謝產(chǎn)物犬尿素，作者使用高效液相色譜法測(cè)定培養(yǎng)基中色氨酸和犬尿素的濃度。犬尿素比色氨酸（K:T）的比例升高，表明IDO活性升高，這在miR-142-5p mimics處理的或者外泌體miR-142-5p處理的HDLEC細(xì)胞上清中都能觀察到(Fig. 3b)。這與IDO蛋白質(zhì)水平的趨勢(shì)一致。

為了評(píng)估外泌體miR-142-5p在體內(nèi)淋巴表型重塑中的作用，將Siha細(xì)胞與Siha/miR-142-5p或miR-142-5p mimics的外泌體處理的條件HDLECs混合，皮下注射到小鼠右側(cè)。15天后，Siha細(xì)胞組顯示更高水平的淋巴管IDO和miR-142-5p表達(dá)以及血漿K:T的比例(Fig. 3c–f)。總之，CSCC分泌外泌體miR-142-5p上調(diào)淋巴管IDO表達(dá)。

圖3 CSCC分泌的外泌體miR-142-5p上調(diào)淋巴細(xì)胞IDO表達(dá)

4、CSCC分泌的外泌體miR-142-5p在HDLECs細(xì)胞中直接靶向ARID2

隨后，使用三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)共同預(yù)測(cè)到6個(gè)miR-142-5p的靶基因，經(jīng)qPCR驗(yàn)證后只有ARID2的表達(dá)發(fā)生顯著改變。熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-142-5p與ARID2的在3’UTR存在直接相互作用，并且這種相互作用在用包含miR-142-5p的外泌體中也可檢測(cè)到，而在對(duì)照組外泌體檢測(cè)不到（圖4a-f）。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，干擾ARID2后IDO的表達(dá)顯著升高，而同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-142-5p mimics則導(dǎo)致IDO的表達(dá)顯著下調(diào)；類似的，干擾ARID2后與外泌體對(duì)照組共孵育，IDO的表達(dá)顯著升高，而與包含miR-142-5p的外泌體孵育則顯著抑制IDO的表達(dá)（圖4g）。不僅如此，HDLEC細(xì)胞上清中K:T的比例也具有相同的變化趨勢(shì)（圖4h）。由于IFN-γ可誘導(dǎo)IDO表達(dá)，所以作者評(píng)估了IFN-γ的表達(dá)是否受到miR-142-5p/ARID2誘導(dǎo)。結(jié)果顯示，miR-142-5p過(guò)表達(dá)或ARID2干擾都導(dǎo)致淋巴管中IFN-γ的表達(dá)顯著上調(diào)，反之則下調(diào)。

圖4 CSCC分泌的外泌體miR-142-5p在HDLECs細(xì)胞中直接靶向ARID2

5、ARID2通過(guò)招募DNMT1增強(qiáng)IFN-γ啟動(dòng)子的甲基化

鑒于ARID2介導(dǎo)IFN-γ的表達(dá)，作者進(jìn)一步探究?jī)烧唛g是否存在直接連接。如圖5a，熒光素酶結(jié)果顯示在ARID2沉默或過(guò)表達(dá)細(xì)胞中IFN-γ的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶活性增加或減少。ChIP-PCR實(shí)驗(yàn)顯示在ARID2中只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(?201 to ?360 bp)與IFN-γ的啟動(dòng)子具有強(qiáng)烈的結(jié)合作用 (Fig. 5b)。因此，ARID2直接抑制IFN-γ的轉(zhuǎn)錄。

作為PBAF的一個(gè)亞基，ARID2具有表觀調(diào)控和調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的潛力。有研究表明DNMT1作為表觀調(diào)節(jié)者被ARID2招募以增強(qiáng)Snail啟動(dòng)子的甲基化。這個(gè)結(jié)果促進(jìn)了學(xué)者對(duì)ARID2- DNMT1復(fù)合物在IFN-γ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中的理解。本文ChIP-RE-CHIP結(jié)果發(fā)現(xiàn)ARID2和DNMT1共同占用了IFN-γ的同一個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域(Fig. 5c)。并且，在ARID2過(guò)表達(dá)的HDLEC細(xì)胞中DNMT1與IFN-γ啟動(dòng)子的結(jié)合增加了，ARID2干擾則相反，表明ARID2募集DNMT1只IFN-γ啟動(dòng)子(Fig. 5d)。此外，本文還發(fā)現(xiàn)CpG(?153 to ?277 bp)與ARID2- DNMT1復(fù)合物在IFN-γ結(jié)合位點(diǎn)重疊(?201 to ?360 bp) (Fig. 5e)。實(shí)驗(yàn)顯示，在ARID2過(guò)表達(dá)或干擾的HDLECs細(xì)胞中IFN-γ啟動(dòng)子的甲基化會(huì)隨之上調(diào)或下調(diào)(Fig. 5f)?？傊@些結(jié)果表明ARID2抑制IFN-γ轉(zhuǎn)錄通過(guò)招募DNMT1至IFN-γ啟動(dòng)子，進(jìn)而上調(diào)啟動(dòng)子的甲基化。

圖5 ARID2通過(guò)招募DNMT1增強(qiáng)IFN-γ啟動(dòng)子的甲基化

6、miR-142-5p激活的HDLECs誘導(dǎo)IDO耗竭CD8+ T細(xì)胞

研究報(bào)道IDO促進(jìn)免疫抑制通過(guò)減低CD8+ T細(xì)胞的響應(yīng)。為了檢測(cè)HDLEC細(xì)胞暴露miR-142-5p是否促進(jìn)CD8+ T細(xì)胞的免疫抑制作用，使用miR-142-5p和miR-142-5p mimics外泌體預(yù)處理的HDLEC細(xì)胞與CD8+ T細(xì)胞共孵育。結(jié)果發(fā)現(xiàn)被含有miR-142-5p外泌體預(yù)處理的HDLEC細(xì)胞會(huì)顯著降低CD69+（激活）的組分和 IFN-γ+ CD8+（影響子）T細(xì)胞組分(Fig. 6a, b)，同時(shí)升高了PD-1+（抑制）和V+（凋亡）標(biāo)記的CD8+T細(xì)胞組分(Fig. 6c, d)。此外，使用IDO阻斷劑或miR-142-5p抑制劑處理則顯著反轉(zhuǎn)了上述對(duì)CD8+ T細(xì)胞的抑制作用(Fig. 6a, d)。因此，IDO導(dǎo)致的免疫抑制是由miR-142-5p暴露介導(dǎo)的。

圖6 miR-142-5p激活的HDLECs誘導(dǎo)IDO耗竭CD8+ T細(xì)胞

7、血漿外泌體miR-142-5p水平與系統(tǒng)IDO活性和臨床CSCC病理進(jìn)展相關(guān)

為了檢測(cè)腫瘤分泌的miR-142-5p能否再CSCC患者血漿中被檢測(cè)到，作者分離了27例早期和17例晚期CSCC患者以及8例健康人的外泌體，這些外泌體都具有典型的外泌體表型。進(jìn)一步qPCR結(jié)果顯示，與健康組外泌體相比，CCC患者血漿分離的外泌體中miR-142-5p的表達(dá)顯著升高，其晚期的要顯著高于早期的(Fig. 7b)，類似的趨勢(shì)也在K:T的比例中觀查到(Fig. 7c)。此外，血漿外泌體中miR-142-5p的表達(dá)與血漿中K:T的比例呈正相關(guān)(Fig. 7d)。

圖7血漿外泌體miR-142-5p水平與系統(tǒng)IDO活性和臨床CSCC病理進(jìn)展相關(guān)

   總之，本文的結(jié)果表明CSCC分泌的外泌體miR-142-5p下調(diào)淋巴管中ARID2的表達(dá)，抑制DNMT1募集至IFN-γ啟動(dòng)子，并增強(qiáng)IFN-γ轉(zhuǎn)錄通過(guò)抑制啟動(dòng)子甲基化，導(dǎo)致IDO活性升高隨后造成耗竭。