LncRNA與轉(zhuǎn)錄因子的研究思路

   導(dǎo)語：FOXA1是一組被稱為先驅(qū)因子的特殊轉(zhuǎn)錄因子(TF)的成員，啟動轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，在乳腺癌、前列腺癌和肺癌的腫瘤發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要。以往關(guān)于FOXA1的研究主要集中在蛋白編碼基因上，長鏈非編碼RNA（lncRNA）是否參與FOXA1調(diào)控網(wǎng)絡(luò)？各位看官，細聽小編慢慢來說。

（IF=8.579） 

技術(shù)路線

結(jié)果

1. DSCAM-AS1是一種由FOXA1調(diào)控的譜系特異性致癌lncRNA

   為揭示FOXA1調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的致癌作用，分析具有致癌功能的FOXA1應(yīng)答lncRNA。TCGA泛癌癥數(shù)據(jù)和癌細胞系百科全書數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)FOXA1在前列腺腺癌(PRAD)、乳腺癌(BRCA)和肺腺癌(LUAD) 中 表達升高。接下來分析PRAD、BRCA和LUAD中異常表達的lncRNA，分析Nacht等人報道的公共si-FOXA1 RNA-seq數(shù)據(jù)，鑒定出5個重疊的lncRNA。ChIP-seq數(shù)據(jù)分析啟動子區(qū)域潛在的FOXA1結(jié)合位點，發(fā)現(xiàn)DSCAM-AS1(ENSG00000235123)在TSS(±10kb)周圍的潛在結(jié)合位點數(shù)量最多。因此，選擇DSCAM-AS1進行進一步研究。TCGA數(shù)據(jù)和CLE數(shù)據(jù)顯示DSCAM-AS1在乳腺癌、肺癌和前列腺癌中特異性表達，在癌旁正常組織中不表達。

2. DSCAM-AS1由FOXA1驅(qū)動的超級增強子直接調(diào)控

   癌癥中基因的異常表達通常是由拷貝數(shù)變異(CNVs)、表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄失調(diào)引起的，首先分析DSCAM-AS1基因體的CNVs狀態(tài)。超級增強子常參與控制譜系特異性表達和細胞鑒別。H3K27ac被公認為是活性增強子和超級增強子的標記。DSCAM-AS1是位于DSCAM基因大內(nèi)含子（約320kb）中的反義lncRNA。DSCAM-AS1具有兩個超級增強子信號，H3k27ac ChIP-seq數(shù)據(jù)顯示兩個超級增強子簇存在于ER + 中，但在ER-乳腺癌細胞系中缺失。發(fā)現(xiàn)一個超級增強子(SE1)覆蓋DSCAM-AS1的整個基因體，包括啟動子區(qū)。另一個超級增強子簇(SE2)在DSCAM-AS1上游約60kb。

   T47D細胞系的Hi-C數(shù)據(jù)分析SE2與SE1以及DSCAM-AS1 TSS之間的相互作用。低濃度下，超級增強子相關(guān)基因?qū)D(zhuǎn)錄抑制劑（如BRD4抑制劑JQ1）高度敏感，極低濃度的JQ1導(dǎo)致DSCAM-AS1顯著減少。ChIP-qPCR檢測顯示DSCAM-AS1上游和基因體區(qū)域H3K27ac均顯著富集。綜上所述，這些數(shù)據(jù)揭示DSCAM-AS1受到超級增強子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。FOXA1是TF的先驅(qū)，并作為雌激素受體轉(zhuǎn)錄功能的關(guān)鍵決定因素。ChIP-seq鑒定FOXA1與DSCAM-AS1綁定。在肺腺癌、乳腺癌和前列腺癌細胞系中敲低FOXA1后SCAM-AS1水平顯著降低。這些揭示FOXA1可直接與DSCAM-AS1的啟動子結(jié)合，并調(diào)節(jié)其在肺腺癌、乳腺癌和前列腺癌細胞中的表達。綜上所述，DSCAM-AS1是FOXA1的直接靶點。

3. DSCAM-AS1通過調(diào)控FOXA1和ERα的表達發(fā)揮致癌作用

    研究DSCAM-AS1在乳腺癌和肺腺癌細胞中的生物學(xué)作用。沉默DSCAMAS1可顯著降低乳腺癌細胞系的增殖、落生長、細胞中G1-S轉(zhuǎn)換。敲除DSCAM-AS1后，在乳腺癌和肺腺癌細胞中觀察到顯著的生長抑制。

   DSCAM-AS1可調(diào)節(jié)FOXA1和ERα超級增強子相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達，它們相互形成正反饋回路，被稱為核心轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)回路(CRC)。為探索超級增強子相關(guān)lncRNA是否也能調(diào)控TF的表達并參與形成CRC，測量敲除DSCAM-AS1后乳腺癌和肺腺癌細胞系中FOXA1的表達。默DSCAM-AS1后FOXA1的mRNA和蛋白水平顯著降低，表明DSCAM-AS1可能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)FOXA1的表達。ERα是ER + 乳腺癌中與FOXA1共結(jié)合的主要調(diào)節(jié)因子。沉默或敲除DSCAM-AS1后，ERα在mRNA和蛋白水平的表達均顯著降低。這些表明DSCAMAS1調(diào)節(jié)FOXA1和ERα的表達。

4. DSCAM-AS1與YBX1相互作用

   探索DSCAM-AS1對FOXA1和ERα調(diào)節(jié)的分子機制。RNA pull-down實驗顯示在約50 KD處強條帶，質(zhì)譜分析該條帶。SURF-6和YBX1是質(zhì)譜獲得的頂級候選物之一，沉默了SURF-6未減少細胞增殖。YBX1是一種DNA結(jié)合和RNA結(jié)合蛋白，轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達。蛋白質(zhì)印跡法、RIP-qPCR實驗進一步驗證這種相互作用。敲低YBX1的MCF7細胞的增殖被抑制。這些揭示DSCAM-AS1的功能依賴于與YBX1的相互作用。

5. DSCAM-AS1的缺失損害YBX1在FOXA1和ERα啟動子區(qū)域的募集
   除作為RNA結(jié)合蛋白，YBX1還作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用。分析YBX1的ChIP-seq數(shù)據(jù)，觀察到FOXA1和ERα的啟動子區(qū)域有明顯的峰值，ChIP-qPCR檢測進一步驗證這些結(jié)合位點。此外，敲除YBX1導(dǎo)致FOXA1和ERα在mRNA和蛋白水平均受到顯著抑制，這揭示了YBX1可轉(zhuǎn)錄激活FOXA1和ERα。沉默DSCAM-AS1后，YBX1的募集顯著減少。這些表明DSCAM-AS1的缺失損害了YBX1在啟動子區(qū)域的結(jié)合，減少了FOXA1和ERα的轉(zhuǎn)錄激活。

6. DSCAM-AS1的臨床相關(guān)性和體內(nèi)功能研究

   為探索DSCAM-AS1表達的臨床相關(guān)性，Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn)DSCAM-AS1的高表達與ER + 乳腺癌患者的低生存期顯著相關(guān)。在肺腺癌中觀察到相似結(jié)果。分析DSCAM-AS1相互作用蛋白YBX1的臨床相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)YBX1的高表達與不良預(yù)后相關(guān)。為研究DSCAM-AS1在體內(nèi)的作用，使用MCF7 DSCAM-AS1 KO細胞進行異種移植試驗。證明DSCAM-AS1缺失影響MCF7異種移植腫瘤的生長，DSCAM-AS1敲除細胞的腫瘤形成率顯著降低。

總結(jié)：

1. DSCAM-AS1被FOXA1驅(qū)動的超級增強子轉(zhuǎn)錄激活，并表現(xiàn)出譜系特異性表達模式；

   2. DSCAM-AS1的缺失抑制細胞生長，并減少FOXA1和ERα的表達；

3. 機制上，DSCAM-AS1與YBX1相互作用，增強YBX1在FOXA1和ERα啟動子區(qū)域的募集。