LncRNA與轉錄因子的研究思路

   導語：FOXA1是一組被稱為先驅因子的特殊轉錄因子(TF)的成員，啟動轉錄網絡，在乳腺癌、前列腺癌和肺癌的腫瘤發(fā)生發(fā)展中至關重要。以往關于FOXA1的研究主要集中在蛋白編碼基因上，長鏈非編碼RNA（lncRNA）是否參與FOXA1調控網絡？各位看官，細聽小編慢慢來說。

（IF=8.579） 

技術路線

結果

1. DSCAM-AS1是一種由FOXA1調控的譜系特異性致癌lncRNA

   為揭示FOXA1調控網絡的致癌作用，分析具有致癌功能的FOXA1應答lncRNA。TCGA泛癌癥數據和癌細胞系百科全書數據發(fā)現FOXA1在前列腺腺癌(PRAD)、乳腺癌(BRCA)和肺腺癌(LUAD) 中 表達升高。接下來分析PRAD、BRCA和LUAD中異常表達的lncRNA，分析Nacht等人報道的公共si-FOXA1 RNA-seq數據，鑒定出5個重疊的lncRNA。ChIP-seq數據分析啟動子區(qū)域潛在的FOXA1結合位點，發(fā)現DSCAM-AS1(ENSG00000235123)在TSS(±10kb)周圍的潛在結合位點數量最多。因此，選擇DSCAM-AS1進行進一步研究。TCGA數據和CLE數據顯示DSCAM-AS1在乳腺癌、肺癌和前列腺癌中特異性表達，在癌旁正常組織中不表達。

2. DSCAM-AS1由FOXA1驅動的超級增強子直接調控

   癌癥中基因的異常表達通常是由拷貝數變異(CNVs)、表觀遺傳和轉錄失調引起的，首先分析DSCAM-AS1基因體的CNVs狀態(tài)。超級增強子常參與控制譜系特異性表達和細胞鑒別。H3K27ac被公認為是活性增強子和超級增強子的標記。DSCAM-AS1是位于DSCAM基因大內含子（約320kb）中的反義lncRNA。DSCAM-AS1具有兩個超級增強子信號，H3k27ac ChIP-seq數據顯示兩個超級增強子簇存在于ER + 中，但在ER-乳腺癌細胞系中缺失。發(fā)現一個超級增強子(SE1)覆蓋DSCAM-AS1的整個基因體，包括啟動子區(qū)。另一個超級增強子簇(SE2)在DSCAM-AS1上游約60kb。

   T47D細胞系的Hi-C數據分析SE2與SE1以及DSCAM-AS1 TSS之間的相互作用。低濃度下，超級增強子相關基因對轉錄抑制劑（如BRD4抑制劑JQ1）高度敏感，極低濃度的JQ1導致DSCAM-AS1顯著減少。ChIP-qPCR檢測顯示DSCAM-AS1上游和基因體區(qū)域H3K27ac均顯著富集。綜上所述，這些數據揭示DSCAM-AS1受到超級增強子的轉錄調控。FOXA1是TF的先驅，并作為雌激素受體轉錄功能的關鍵決定因素。ChIP-seq鑒定FOXA1與DSCAM-AS1綁定。在肺腺癌、乳腺癌和前列腺癌細胞系中敲低FOXA1后SCAM-AS1水平顯著降低。這些揭示FOXA1可直接與DSCAM-AS1的啟動子結合，并調節(jié)其在肺腺癌、乳腺癌和前列腺癌細胞中的表達。綜上所述，DSCAM-AS1是FOXA1的直接靶點。

3. DSCAM-AS1通過調控FOXA1和ERα的表達發(fā)揮致癌作用

    研究DSCAM-AS1在乳腺癌和肺腺癌細胞中的生物學作用。沉默DSCAMAS1可顯著降低乳腺癌細胞系的增殖、落生長、細胞中G1-S轉換。敲除DSCAM-AS1后，在乳腺癌和肺腺癌細胞中觀察到顯著的生長抑制。

   DSCAM-AS1可調節(jié)FOXA1和ERα超級增強子相關轉錄因子的表達，它們相互形成正反饋回路，被稱為核心轉錄調節(jié)回路(CRC)。為探索超級增強子相關lncRNA是否也能調控TF的表達并參與形成CRC，測量敲除DSCAM-AS1后乳腺癌和肺腺癌細胞系中FOXA1的表達。默DSCAM-AS1后FOXA1的mRNA和蛋白水平顯著降低，表明DSCAM-AS1可能在轉錄水平調節(jié)FOXA1的表達。ERα是ER + 乳腺癌中與FOXA1共結合的主要調節(jié)因子。沉默或敲除DSCAM-AS1后，ERα在mRNA和蛋白水平的表達均顯著降低。這些表明DSCAMAS1調節(jié)FOXA1和ERα的表達。

4. DSCAM-AS1與YBX1相互作用

   探索DSCAM-AS1對FOXA1和ERα調節(jié)的分子機制。RNA pull-down實驗顯示在約50 KD處強條帶，質譜分析該條帶。SURF-6和YBX1是質譜獲得的頂級候選物之一，沉默了SURF-6未減少細胞增殖。YBX1是一種DNA結合和RNA結合蛋白，轉錄和轉錄后水平調節(jié)基因表達。蛋白質印跡法、RIP-qPCR實驗進一步驗證這種相互作用。敲低YBX1的MCF7細胞的增殖被抑制。這些揭示DSCAM-AS1的功能依賴于與YBX1的相互作用。

5. DSCAM-AS1的缺失損害YBX1在FOXA1和ERα啟動子區(qū)域的募集
   除作為RNA結合蛋白，YBX1還作為轉錄因子發(fā)揮作用。分析YBX1的ChIP-seq數據，觀察到FOXA1和ERα的啟動子區(qū)域有明顯的峰值，ChIP-qPCR檢測進一步驗證這些結合位點。此外，敲除YBX1導致FOXA1和ERα在mRNA和蛋白水平均受到顯著抑制，這揭示了YBX1可轉錄激活FOXA1和ERα。沉默DSCAM-AS1后，YBX1的募集顯著減少。這些表明DSCAM-AS1的缺失損害了YBX1在啟動子區(qū)域的結合，減少了FOXA1和ERα的轉錄激活。

6. DSCAM-AS1的臨床相關性和體內功能研究

   為探索DSCAM-AS1表達的臨床相關性，Kaplan-Meier分析發(fā)現DSCAM-AS1的高表達與ER + 乳腺癌患者的低生存期顯著相關。在肺腺癌中觀察到相似結果。分析DSCAM-AS1相互作用蛋白YBX1的臨床相關性，發(fā)現YBX1的高表達與不良預后相關。為研究DSCAM-AS1在體內的作用，使用MCF7 DSCAM-AS1 KO細胞進行異種移植試驗。證明DSCAM-AS1缺失影響MCF7異種移植腫瘤的生長，DSCAM-AS1敲除細胞的腫瘤形成率顯著降低。

總結：

1. DSCAM-AS1被FOXA1驅動的超級增強子轉錄激活，并表現出譜系特異性表達模式；

   2. DSCAM-AS1的缺失抑制細胞生長，并減少FOXA1和ERα的表達；

3. 機制上，DSCAM-AS1與YBX1相互作用，增強YBX1在FOXA1和ERα啟動子區(qū)域的募集。